Γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα στην εξελικτική - αναπτυξιακή βιολογία

Τα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα (GRNs) αποτελούν σύνολα μοριακών ρυθμιστών, οι οποίοι αλληλεπιδρούν τόσο μεταξύ τους όσο και με άλλα συστατικά του κυττάρου, καθορίζοντας τα επίπεδα έκφρασης του mRNA, επομένως και των πρωτεϊνών. Τα δίκτυα αυτά θεωρείται ότι διαδραματίζουν εξέχοντα ρόλο στην μορφογένεση και στη δημιουργία των δομών του σώματος όπως τις γνωρίζουμε, συστατικά τα οποία με τη σειρά τους φέρουν κεντρική σημασία για την εξελικτική αναπτυξιακή βιολογία (Evolutionary developmental biology, evo-devo).

Η evo-devo αποτελεί πεδίο βιολογικής έρευνας και αναφέρεται στη μελέτη αναπτυξιακών προγραμμάτων και μοτίβων υπό μια εξελικτική προοπτική. Συγκρίνοντας τις αναπτυξιακές διαδικασίες διαφόρων οργανισμών και εντοπίζοντας τις προγονικές σχέσεις μεταξύ τους, επιδιώκεται η κατανόηση των διαφόρων επιρροών που διαμορφώνουν τη μορφή και τη φύση της ζωής στον πλανήτη.

Οι οργανισμοί αποκτούν τη μορφή και τη λειτουργία τους μέσω ενός περίπλοκου δικτύου κανονιστικών σχέσεων μεταξύ DNA, RNA, πρωτεϊνών και μεταβολιτών. Συγκεκριμένα, μοριακές γενετικές μελέτες οργανισμών μοντέλων υποδεικνύουν ότι οι αναπτυξιακές διαδικασίες ελέγχονται συνήθως από τα προαναφερθέντα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα, τα συστατικά των οποίων συνδέονται μεταξύ τους με διάφορους τύπους ρυθμιστικών αλληλεπιδράσεων και τελικά υπαγορεύουν τα πρότυπα έκφρασης σε ένα κύτταρο. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο οι αλλαγές στα δίκτυα αυτά οδηγούν στην εμφάνιση φαινοτυπικών καινοτομιών αποτελεί σημαντική πρόκληση για την evo-devo.

Οι τεχνολογικές πρόοδοι στον τομέα των βιολογικών αναλύσεων και οι συνεχείς βελτιώσεις στην αποδοτικότητα σε συνδυασμό με τη μείωση του κόστους της αλληλούχησης συνεισφέρουν επαναστατικά στην κατανόηση της πολυπλοκότητας των μεταγραφημάτων διαφόρων οργανισμών και παρέχουν ολοένα και περισσότερες πληροφορίες γι’ αυτόν τον ιστό ρύθμισης σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος. Αυτή η έκρηξη δεδομένων γονιδιακής κλίμακας προώθησε την ανάπτυξη υπολογιστικών μεθόδων, επιτρέποντας μια περισσότερο ολοκληρωμένη μελέτη για το πώς τα μόρια δημιουργούν διαφορετικούς φαινοτύπους. Συγκεκριμένα, μέσω της χρήσης της ανάλυσης δικτύων, παρακλάδι της θεωρίας γράφων των μαθηματικών και της επιστήμης των υπολογιστών, καταφέρνουν να μοντελοποιούνται οι σχέσεις μεταξύ μονάδων βιολογικών δεδομένων. Το πεδίο της εξελικτικής αναπτυξιακής βιολογίας αξιοποιεί αυτά τα δεδομένα προς την καλύτερη κατανόηση του τρόπου με τον οποίο οι οργανισμοί αναπτύσσονται, εξελίσσονται και ανταποκρίνονται στα βιοτικά και αβιοτικά ερεθίσματα.

Ιστορία

Ο τομέας της evo-devo ξεκίνησε να αναπτύσσεται στις αρχές του 19^ου αιώνα. Η δημοσίευση της εργασίας «Η προέλευση των ειδών» από τον Κάρολο Δαρβίνο (1859) και η θεωρία του Ernst Haeckel η οποία συσχετίζει την οντογένεια με τη φυλογένεια (1866), ώθησε τους εξελικτικούς εμβρυολόγους και μορφολόγους της εποχής να μελετήσουν την εξελικτική αναπτυξιακή βιολογία. Από τα τέλη της δεκαετίας του 1860 μέχρι τα μέσα της δεκαετίας του 1880, η εξελικτική εμβρυολογία κέντρισε το ενδιαφέρον των καλύτερων ζωολόγων της εποχής.

Ωστόσο, μετά τη δεκαετία του 1880 αυξήθηκαν οι πειραματικές και φυσιολογικές προσεγγίσεις για την μελέτη της εμβρυικής εξέλιξης και παράλληλα ήρθαν στο προσκήνιο τα πειράματα του Γκρέγκορ Μέντελ και οι νόμοι της Μενδελιανής γενετικής. Τα γεγονότα αυτά είχαν ως αποτέλεσμα πολύ μικρή πρόοδο της εξελικτικής αναπτυξιακής βιολογίας για περίπου ένα αιώνα, μέχρι τα τέλη της δεκαετίας του 1970. Το 1977, η τεχνολογία του ανασυνδιασμένου DNA στη γενετική, καθώς και το βιβλίο του Stephen J. Gould «Οντογένεια και Φυλογένεια», επαναφέραν το ενδιαφέρον για την μελέτη της εξελικτικής αναπτυξιακής βιολογίας. Το 1978, ο Edward B. Lewis ανακάλυψε τα ομοιοτικά γονίδια, τα οποία είναι υπεύθυνα για τον προσδιορισμό της πρόσθιας, οπίσθιας, ραχιαίας και κοιλιακής πλευράς στο έμβρυο του είδους Drosophila melanogaster. Γρήγορα διαπιστώθηκε πως όλα τα ζώα, καθώς και τα φυτά και οι μύκητες διαθέτουν ομοιοτικά γονίδια, γεγονός το οποίο έδωσε ακόμα μεγαλύτερη ώθηση στην μελέτη της εξελικτικής αναπτυξιακής βιολογίας.

Σήμερα, οι τεχνολογικές προόδοι έχουν βελτιώσει την έρευνα της εξελικτικής αναπτυξιακής βιολογίας μέσω δικτύων.

Δίκτυα εξελικτικής και αναπτυξιακής βιολογίας

Τα πρώτα δίκτυα που σχετίζονταν με την αναπτυξιακή και εξελικτική βιολογία (όπως αυτό του Davidson et al. 11)) δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας απευθείας πειραματικά δεδομένα για την αναπαράσταση ενός κατευθυνόμενου δικτύου. Παρ’ ότι αυτά τα δίκτυα ήταν μικρά σε μέγεθος (περίπου 40 γονίδια), αποτέλεσαν ένα μεγάλο βήμα στην κατανόηση των αναπτυξιακών διαδικασιών(11). Αυτά τα πρώτα μοντέλα δικτύων αποτελούνταν από ένα ή δύο τύπους μαθηματικών αναλύσεων-μοντλελων, το Λογικό ή Boolean μοντέλο (δυαδικά) και το δυναμικό μοντέλο συστημάτων (). Ένα Boolean δίκτυο αποτελείται από γονίδια-κόμβους που μπορούν να έχουν δύο μόνο καταστάσεις, και άρα να πάρουν δύο τιμές: Ενεργοποιημένη (1) ή απενεργοποιημένη (0) , και η οποία μπορεί να ρυθμίζεται κατ’ επέκταση από άλλα γονίδια. Αυτή η μέθοδος μπορεί να ερμηνεύσει-αναδείξει βρόχους ανάδρασης (feedback loops) καθώς και γονίδια που ρυθμίζουν τη δραστηριότητα άλλων γονιδίων (όπως μεταγραφικοί παράγοντες), αλλά αδυνατεί να ερμηνεύσει μεταβαλλόμενες καταστάσεις έκφρασης ενός γονιδίου καθώς αυτό, με βάση το συγκεκριμένο μοντέλο, μπορεί να βρίσκεται σε δύο μόνο καταστάσεις μέσα στο κύτταρο.(12) Τα δυναμικά συστήματα αντιθέτως χρησιμοποιούν διαφορικές εξισώσεις οι οποίες επιτρέπουν την ερμηνεία μεταβαλλόμενων καταστάσεων έκφρασης γονιδίων και μη γραμμικών αλληλεπιδράσεων. Βέβαια τα μοντέλα αυτά είναι αρκετά περιορισμένα ως προς την υπολογιστική δύναμη.(12)

Μελέτες evo-devo έχουν υπογραμμίσει τη σημασία της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης στην εξέλιξη και στην ανάπτυξη των οργανισμών, υποδηλώνοντας την σύνδεση των αναπτυξιακών γενετικών ρυθμιστικών δικτύων (GRNs) με την εξέλιξη (Sinha2016). Για να κατανοηθεί όμως αυτή η σύνδεση και να γίνουν αντιληπτές οι πληροφορίες που παρέχουν τα GRNs σχετικά με την εξέλιξη και την ανάπτυξη, χρειάζεται να αναφερθούν τα τμήματα που απαρτίζουν τέτοια δίκτυα. Ο εντοπισμός -μέσω της μελέτης των GRNs- γονιδίων και/ή συστατικών των δικτύων που συνεισφέρουν σημαντικά στην εξέλιξη των οργανισμών, αποτελεί σημαντικό στόχο με μεγάλο ενδιαφέρον για την evo-devo (Sinha2016).

Τοπολογία γενετικών ρυθμιστικών δικτύων

Σε ένα γενετικό ρυθμιστικό δίκτυο οι κόμβοι του αντιπροσωπεύουν τα γονίδια (ή τα συστατικά αυτών) και οι ακμές τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους (όπως η στόχευση γονιδίων για ενεργοποίηση ή καταστολή). Κόμβοι που φέρουν εξαιρετικά υψηλό βαθμό συνδεσιμότητας ονομάζονται υπερκόμβοι (hubs) και θεωρούνται απαραίτητοι για πολλές κυτταρικές λειτουργίες και για τη βιωσιμότητα των οργανισμών (tsakanikas page 17 pdf). Τα γονίδια υπερκόμβων αντιπροσωπεύουν ένα μικρό ποσοστό κόμβων με μέγιστη ανταλλαγή πληροφοριών με άλλους κόμβους και τείνουν να συνδέονται με ουσιαστικούς ρόλους στις βιολογικές διεργασίες. Θεωρείται ότι η εξέλιξη και η ανάπτυξη πιθανόν να ρυθμίζονται από τέτοια τμήματα των δικτύων όπου οι παράγοντες μεταγραφής λειτουργούν ως γονίδια υπερκόμβων. Αυτά τα γονίδια, εντοπίζονται κεντρικά του δικτύου αλληλεπιδράσεων και θεωρούνται ότι δρουν ως ρυθμιστές πολλών άλλων ρυθμιστικών γονιδίων. Επιπλέον, γονίδια που είναι πολύ διασυνδεδεμένα στο δίκτυο συνήθως εμπλέκονται στις ίδιες βιολογικές μονάδες του δικτύου ή στα ίδια μονοπάτια (Sinha2016). Από την άλλη, τα μη ρυθμιστικά γονίδια εντοπίζονται στην περιφέρεια του δικτύου και συνδέονται με λίγα γονίδια, τα οποία με τη σειρά τους συνδέονται με μηδέν ή ακόμη λιγότερα γονίδια. Αν και μερικά περιφερειακά γονίδια μπορεί να είναι ρυθμιστικά, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που κωδικοποιούν παράγοντες μεταγραφής, ένα δίκτυο ρυθμιστικών γονιδιακών αλληλεπιδράσεων, τοποθετώντας τα στην περιφέρεια, φανερώνει γι αυτά μικρή σχέση με το σύστημα ελέγχου (https://academic.oup.com/icb/article/52/6/842/599969).

Ανάλυση Δικτύων

Ο τεράστιος όγκος των διαθέσιμων μεταγραφομικών δεδομένων ολόκληρων γονιδιωμάτων πλέον έχει καταστήσει την κατασκευή των δικτύων τους άμεσα διαθέσιμη για τους περισσότερους ερευνητές.(16) Για την κατασκευή και ανάλυση ενός τέτοιου δικτύου, τα δεδομένα που παρέχονται από τεχνικές όπως RNA-seq ή μικροσυστοιχίες (microarray) αρχικά κανονικοποιούνται κατάλληλα. Στη συνέχεια τα γονίδια χρειάζεται να ομαδοποιηθούν σε υποσύνολα προκειμένου να διευκολυνθεί η απεικόνιση των δεδομένων.(17) Αυτό το στάδιο περιλαμβάνει μεθόδους διαφορικής γονιδιακής έκφρασης (differential gene expression, DGE) και ομαδοποίησης (clustering) όπως η ανάλυση κύριων συνιστωσών (principal component analysis, PCA), οι αυτό-οργανωμένοι χάρτες (self-organizing maps, SOM) και t-distributed stochastic neighbor embedding, t-SNE (18-22).

Μέθοδοι Ομαδοποίησης γονιδίων (grouping)

Κάθε μία από τις μεθοδολογίες που αναφέρονται αποτελούν τεχνικές μείωσης διαστάσεων (Dimensionality Reduction – DR) που προσπαθούν να προβάλουν ένα σύνολο από διανύσματα υψηλής διάστασης σε ένα χώρο χαμηλότερης διάστασης. Με αυτόν τον τρόπο οι τεχνικές αυτές μειώνουν την πολυπλοκότητα των δικτύων μετατρέποντας τα σε δυσδιάστατες, εύκολα ερμηνεύσιμες και αντιπροσωπευτικές δομές (18 19 20).

Η ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis – PCA) είναι μία στατιστική διαδικασία για τη μείωση των διαστάσεων η οποία μετατρέπει μία ομάδα τιμών (παρατηρήσεων) δυνητικά συσχετιζόμενων μεταβλητών σε μία ομάδα νέων τιμών μη γραμμικά συσχετιζόμενων μεταβλητών οι οποίες καλούνται κύριες συνιστώσες. Βέβαια το αποτέλεσμα δεν αντιπροσωπεύει συχνά την πραγματική συσχέτιση των γονιδίων(19 20)

Ο αλγόριθµος k-means (k-µέσων) είναι ένας αλγόριθµος που οµαδοποιεί τις τιμές βάσει των χαρακτηριστικών των k ομάδων (clusters). Αποτελεί μεταβλητή του αλγόριθμου μεγιστοποίησης αναµονής (expectation-maximization algorithm-EM). Η χρήση αυτού δίνει μία καλύτερη αναπαράσταση της σχέσης των αντικειμένων.

Οι ιεραρχικοί αλγόριθμοι ομαδοποίησης δημιουργούν ένα ιεραρχικό δέντρο με κόμβους που αναπαριστούν τα clusters μέσω πολλαπλών διαφορετικών μεθόδων. Αν και η ιεραρχική ομαδοποίηση παρέχει πιο «ενημερωμένο» αποτελέσματα, λάθη συγχώνευσης μπορεί να οδηγήσουν σε απώλεια σημαντικών ομάδων γονιδίων (18). Όλες oι παραπάνω μέθοδοι βασίζονται σε Ευκλείδειες αποστάσεις για μέτρα ομοιότητας/ ανομοιότητας μεταξύ γονιδίων εντός χώρων υψηλών διαστάσεων, οι οποίοι από τη φύση τους δεν περιορίζονται εύκολα σε γραμμικές σχέσεις.

Oι αυτό-οργανωμένοι χάρτες (self-organizing maps, SOM) και τα t-SNE (t-distributed stochastic neighbor embedding) χρησιμοποιούν μη γραμμικά μέτρα απόστασης για την προσέγγιση της σχέσης μεταξύ των γονιδίων στον χώρο υψηλών διαστάσεων και συνεπώς παρέχουν μια πιο ρεαλιστική αναπαράσταση της ομοιότητας γονιδίων στις δύο διαστάσεις(19, 21, 22, 23).

Αυτήν η κατανομή των εκφραζόμενων γονιδίων διευκολύνει όχι μόνο την απεικόνιση των δεδομένων αλλά και την εστίαση της ανάλυσης σε εξειδικευμένα βιολογικά ερωτήματα. Μετά τον διαχωρισμό των γονιδίων σε ομάδες με παρόμοια πρότυπα έκφρασης πραγματοποιούνται δοκιμές για τον εντοπισμό της φύσης των γονιδίων (gene ontology κ.ά.) μέσα στις ομάδες (24). Στη συνέχεια πραγματοποιείται η κατασκευή των δικκτύων.

Κατασκευή δικτύων (Network construction)

Υπάρχουν τρείς κύριοι τύποι δικτύου που χρησιμοποιούνται στην εξελικτική και αναπτυξιακή βιολογία:

1. Τα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα (gene regulatory networks, GRNs) που είναι κατευθυνόμενα ως προς την αλληλεπίδραση μεταξύ των κόμβων/γονιδίων
2. Τα δίκτυα σύνδεσης (association networks) τα οποία είναι μη κατευθυνόμενα και δείχνουν τις άμεσες αλληλεπιδράσεις μεταξύ συσχετιζόμενων γονιδίων και
3. Τα γενετικά δίκτυα συνέκφρασης (gene coexpression networks-GCN) τα οποία είναι μη κατευθυνόμενα και μπορούν να δείξουν άμεσες ή έμμεσες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των γονιδίων.\Μετα σύνολα των μεταγραφικών δεδομένων που υπάρχουν διαθέσιμα τα γενετικά δίκτυα συνέκφρασης, GCN αποτελούν το πιο ευέλικτο εργαλείο για την μελέτη αλληλεπίδρασης γονιδίων, χρησιμοποιώντας τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης για τον προσδιορισμό πιθανών συσχετίσεων και modularity.(16) Αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο με οργανισμούς μη μοντέλα στα οποία η λειτουργία των περισσότερων γονιδίων δεν έχει προσδιοριστεί και συνεπώς οι ρυθμιστικές αλληλεπιδράσεις παραμένουν άγνωστες.

Τα δίκτυα συνέκφρασης γονιδίων (GCN) χρησιμοποιούν κατά κύριο λόγο δύο μεθόδους κατασκευής(εικόνα). (Α) Η πρώτη στηρίζεται στη συσχέτιση και στις περισσότερες περιπτώσεις στη συσχέτιση Pearson για τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των γονιδίων. Έτσι η βαθμιαία συσχέτιση γονιδίου με ένα άλλο δημιουργεί την συνολική αρχιτεκτονική του δικτύου. Ο συντελεστής συσχέτισης του Pearson δίνει ένα μέτρο της γραμμικής συσχέτισης μεταξύ δύο μεταβλητών (γονιδίων) αλλά αδυνατεί να ερμηνεύσει ακραίες τιμές ή συσχετίσεις γονιδίων οι οποίες δεν είναι γραμμικές. Ο Συντελεστής συσχέτισης του Spearman αντιμετωπίζει αυτά τα προβλήματα ερμηνεύοντας ακραίες τιμές και συσχετίσεις γονιδίων οι οποίες δεν είναι γραμμικές. (Β) Η δεύτερη ανήκει στις εποπτικές μεθόδους-supervised methods κατά τις οποίες χρησιμοποιείται σύνολο γονιδίων σαν προβλέψεις για την σχέση αλληλεπίδρασης ενός συγκεκριμένου γονιδίου. Με αυτό τον τρόπο δημιουργείται ένα περισσότερο κατευθυνόμενο δίκτυο. Η συγκεκριμένη μέθοδος μπορεί να αντιμετωπίζει καλύτερα μεταβαλλόμενες εκφράσεις των γονιδίων, όμως είναι λιγότερο αξιόπιστη στην περίπτωση μελέτης των βρόχων ανάδρασης(16). Ο συνδυασμός διάφορων μαθηματικών τεχνικών είναι προτιμότερος για τη επίτευξη μιας ακριβέστερης αναπαράστασης των συσχετίσεων των γονιδίων(16). Τα GCNs μπορούν να αναδείξουν τις αλληλεπιδράσεις και βιολογικές λειτουργίες και είναι χρήσιμες τόσο σε οργανισμούς μοντέλα, όσο και σε μη. Άλλες μέθοδοι περιλαμβάνουν πιθανολογικά μοντέλα (probabilistic graphical models-PGMs) στα οποία ανήκουν τα Bayesian και τα Markov μοντέλα.Τα Bayesian αποτελούν κατευθυνόμενα δίκτυα, παρέχοντας με αυτόν τον τρόπο κατεύθυνση στην σχέση των γονιδίων του δικτύου(16). Με την κατασκευή του GCN δικτύου, προσδιορίζεται στη συνέχεια η αλληλεπίδραση μεταξύ των γονιδίων καθώς και άλλες πληροφορίες όπως λειτουργικότητα γονιδίων και οι βιολογικές διεργασίες που ρυθμίζονται. Η χρήση συγκριτικών GCN και ανάλυση των συγκεκριμένων δικτύων σε διαφορετικά είδη μπορεί να δώσει πιο ακριβείς λειτουργικότητες γονιδίων στα είδη καθώς συντηρημένα γονίδια μπορεί να σχετίζονται λειτουργικά. Μία από τις πιο ελκυστικές πτυχές των GCN είναι ότι ολόκληρα μεταγραφομικά δεδομένα μπορούν να συνδυαστούν με άλλα δίκτυα μεγάλης κλίμακας όπως τα μεταβολομικά ή τα δίκτυα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (27) παρέχοντας μεγαλύτερη εικόνα για την πραγματική φύση των βιολογικών διαδικασιών στις οποίες ανήκουν οι ομάδες των γονιδίων. Βέβαια, πλέον τα διαθέσιμα μεταγραφομικά δεδομένα υπερβαίνουν κατά πολύ τις υπολογιστικές δυνατότητες, δημιουργώντας περισσότερο εμπόδιο στους ερευνητές παρά μία βοήθεια.

Παραδείγματα

Αναλύσεις evo-devo κατά κανόνα ξεκινούν από ένα καλά εδραιωμένο, σε μελέτες, μοντέλο δικτύων μεταξύ τουλάχιστον δύο οργανισμών. Η κατανόηση των σχέσεων μεταξύ όλων των οργανισμών είναι, άλλωστε, ο βασικός στόχος των βιολογικών επιστημών. Ένα πρώτο βήμα στην evo-devo μελέτη είναι η σύγκριση μορφολογικών και αναπτυξιακών δεδομένων σε φυλογενετικά δέντρα με σκοπό την κατανόηση των μορφολογικών και αναπτυξιακών διεργασιών που έχουν λάβει μέρος. Πολυάριθμες μελέτες και συγκρίσεις γενετικών ρυθμιστικών δικτύων (GRNs) έχουν πραγματοποιηθεί τόσο σε οργανισμούς που αποτελούν μοντέλα στη βιολογία, όσο και σε οργανισμούς που δεν αποτελούν. Ένα μειονέκτημα, είναι ότι για μη οργανισμούς μοντέλα δεν έχουν πραγματοποιηθεί αρκετές μελέτες. Παρά τους πειραματικούς περιορισμούς, πολλές τεχνικές μπορούν να εφαρμοστούν για να μελετήσουμε τα GRNs σε μη-οργανισμούς μοντέλα μέσω εύκολων και ευρέως χρησιμοποιούμενων τεχνικών, όπως για παράδειγμα αλληλούχιση γονιδιώματος και μελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (protein-protein interactions, ppi). Συγκρίνοντας τοπολογίες δικτύων διαφορετικών ειδών, μπορούμε να βγάλουμε συμπέρασμα για προγονικές καταστάσεις των δικτύων σε πολλά διαφορετικά επίπεδα, όσον αφορά τη φυσιολογία των οργανισμών.

Σηματοδοτικό μονοπάτι Skeletogenic

Πρόσφατες έρευνες στην ανάπτυξη του αχινού παρέχει πληροφορίες για εξειδικευμένα GRNs που οδηγούν σε κυτταρική διαφοροποίηση. Tα εμβρυικά κύτταρα του αχινού ανταγωνίζονται μεταξύ τους για την επαγωγή του σκελετογονικού ρυθμιστικού δικτύου (skeletogenic GRN) και τη δημιουργία του σκελετού.  Αυτό σημαίνει ότι κάθε κύτταρο του εμβρύου μπορεί να ενεργοποιήσει το συγκεκριμένο μονοπάτι. Τα πρώτα μεσεγχυματικά κύτταρα του εμβρύου είναι εκέινα που επάγουν το συγκεκριμένο δίκτυο.

KNOX γονίδια στην τομάτα

Αναλύσεις γενετικών δικτύων στην καλλιεργούμενη τομάτα και στα αγρίου τύπου συγγενικά είδη της, έχουν αποκαλύψει τη δομή των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων τους σχετικών με την ανάπτυξη των φύλλων τους. Συγκριτικές αναλύσεις των δικτύων μεταξύ των ειδών ταυτόχρονα με πειραματικές μελέτες (30), εντόπισαν την παρουσία ενός μικρότερου περιφερειακού υποδικτύου υπεύθυνου για τη ρύθμιση της φυλλικής πολυπλοκότητας, το οποίο φαίνεται να επηρεάζει το κύριο δίκτυο που απαρτίζεται από ρυθμιστές του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των φύλλων (31). Τα γονίδια των μεταγραφικών παραγόντων KNOX1 (KNOTTED-LIKE HOMEOBOX) εμφανίστηκαν να δρουν ως συνδετικός κρίκος των δικτύων (εικόνα). Συγκρίσεις δικτύων στα οποία πραγματοποιήθηκαν αλλαγές συστατικών ικανές να μεταβάλλουν τη ρύθμιση των KNOX, οδήγησαν σε παραλλαγές της φυλλικής πολυπλοκότητας, συμφωνώντας με παλαιότερες μελέτες evo-devo κατά τις οποίες αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες επανειλημμένα επηρέαζαν την μεταβολή του φυλλικού σχήματος. Τα δεδομένα αυτά και η θέση εντοπισμού των μεταγραφικών παραγόντων μεταξύ των δικτύων, καθιστά τα KNOX πιθανά εξελικτικά hotspots.

Σηματοδοτικό μονοπάτι Hedgehog

Χαρακτηριστικό παράδειγμα κατά την εξέταση της παρουσίας κοινής εξελικτικής προέλευσης μεταξύ οργανισμών, αποτελεί η μελέτη των συστατικών του σηματοδοτικού μονοπατιού Hedgehog, το οποίο εμπλέκεται σε πολλές αναπτυξιακές διεργασίες του υποβασιλείου των Ευμεταζώων.  Οι αλληλεπιδράσεις  μεταξύ των πρωτεϊνών που συντονίζουν το μονοπάτι, όπως αυτές της οικογένειας Patched και Smoothened και οι μεταγραφικοί παράγοντες Ci και Gli, είναι υψηλά συντηρημένες. Επιπλέον, οι ίδιες οι πρωτεΐνες είναι λειτουργικά εξαρτημένες μεταξύ τους, καθώς δεν μπορούν να μεταβληθούν χωρίς να προκληθεί μεταβολή στα υπόλοιπα συστατικά του δικτύου.

Ανθοογένεση στα φυτά Arabidopsis thaliana και Cardamine hirsute

Παράδειγμα οργανισμών, όσον αφορά τα φυτά, που έχουν μελετηθεί αποτελεί το ζευγάρι οργανισμών Arabidopsis thaliana και Cardamine hirsute και αφορά την ανθογένεση. Τα δύο αυτά φυτά διαφέρουν στην μορφολογία του φύλλου και την δομή του άνθους. Βέβαια, ο δεύτερος οργανισμός δεν αποτελεί οργανισμό μοντέλο στην βιολογία. Ανάλυση evo-devo των μοριακών μηχανισμών που επάγουν την ανθογένεση έχουν γίνει μόνο στο Arabidopsis thaliana. Στη συνέχεια μπορούμε, μέσω των μεθόδων που αναφέρονται παραπάνω, να μελετήσουμε το ίδιο ρυθμιστικό δίκτυο και στο Cardamine hirsuta. Μέσω σύγκρισης των δύο δικτύων είναι δυνατό να βγάλουμε συμπεράσματα για ένα αρχέγονο δίκτυο που από το οποίο προέκυψαν.  

Μελλοντική εξέλιξη

Είναι θεωρητικά δύσκολο να πούμε ποιο είναι το μέλλον της evo-devo καθώς και τι θα προσφέρει η evo-devo στο μέλλον. Παρόλα αυτά, είναι σίγουρο ότι η επιστήμη αυτή θα προσφέρει πολλές πληροφορίες στο πως αλλαγές στην ανάπτυξη σχετίζονται με αλλαγές στην εξέλιξη των οργανισμών. Η μείωση του κόστους αλληλούχισης του DNA και άλλων μοριακών τεχνικών (RNA seq, rtPCR) οδηγεί σε αύξηση του αριθμού των οργανισμών που δεν αποτελούν μοντέλα στη βιολογία και μελέτης τους σε μικρό χρόνο. Επίσης, ο χαρακτηρισμός νέων μαρτύρων, όπως για παράδειγμα της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (red fluorescent protein, RFP) , η βελτιστοποίηση νέων τεχνικών (CRISP/Cas9) έχει συμβάλει σε αυτήν την πρόοδο. Με αυτόν τον τρόπο σύντομα θα έχουμε στα χέρια μας πληροφορίες για γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα από τεράστιο αριθμό οργανισμών και θα μπορούμε να τα συγκρίνουμε μεταξύ τους και να κατασκευάσουμε την εξελικτική τους διαμόρφωση.