Γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα

Ένα  γενετικό ρυθμιστικό δίκτυο (Gene Regulatory Network- GRN) αποτελεί ένα σύνολο τμημάτων DNA στο εσωτερικό ενός κυττάρου, τα οποία αλληλεπιδρούν (έμμεσα) μεταξύ τους, μέσω των προϊόντων της έκφρασής τους, δηλαδή RNA ή πρωτεΐνες καθώς και με άλλα συστατικά του κυττάρου, επηρεάζοντας έτσι τον ρυθμό με τον οποίο τα γονίδια στο δίκτυο αυτό μεταγράφονται σε mRNA. Έτσι η δραστηριότητα των λειτουργικών προΐόντων ενός γονιδίου δεν επηρεάζεται μόνο απο τους μεταγραφικούς παράγοντες και άλλους συμπαράγοντες που επηρεάζουν τη μεταγραφή αλλά και από την αποικοδόμηση πρωτεϊνών και μεταγράφων DNA καθώς και απο τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών.

Εισαγωγή

Τα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε κάθε διαδικασία της ζωής ενός κυττάρου, από την κυτταρική διαφοροποίηση και τον μεταβολισμό μέχρι τον κυτταρικό κύκλο και τη μεταγωγή σήματος. Η γονιδιακή έκφραση σε ορισμένες απο αυτές τις βιολογικές διαδικασίες είναι περισσότερο ντετερμινιστική ενώ σε άλλες περισσότερο στοχαστική. Για παράδειγμα, στην κυτταρική διαφοροποίηση και στον κυτταρικό κύκλο, τα πρότυπα έκφρασης είναι πιο αυστηρά και έτσι μονάχα μερική απόκλιση απo την προκαθορισμένη γονιδιακή έκφραση είναι επιτρεπτή. Αντίθετα, στην απόκριση σε διαφόρων ειδών καταπονήσεις (στρες), η έκφραση των γονιδίων δεν είναι τόσο αυστηρή και μπορεί να μεταβάλλεται ανάλογα με τις υπάρχουσες συνθήκες τόσο μεταξύ διαφορετικών κυττάρων, όσο και μεταξύ διαφορετικών ατόμων. Η βιολογική ευρωστία και στοχαστικότητα δύναται να μελετηθούν στο επίπεδο της διαφορικής γονιδιακής έκφρασης μέσω των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων.

Η μελέτη των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων αποτελεί σημαντικό πυλώνα ενός νέου κλάδου της επιστήμης που ονομάζεται Βιολογία Συστημάτων. Μέσω υπολογιστικών-μαθηματικών μοντέλων μπορεί να γίνει πρόβλεψη της δράσης και της δομής τέτοιων δικτύων και να διευκολυνθεί η περεταίρω μελέτη τους μέσω της βασικής έρευνας αλλά και βιοτεχνολογικών εφαρμογών. Η αποσαφήνιση των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων έχει ώς στόχο την κατανόηση των μηχανισμών των διάφορων ασθενειών που οφείλονται στην απορρύθμιση των κυτταρικών διαδικασιών.

Κατασκευή - Μοντελοποίηση

Η κατασκευή ενός γενετικού ρυθμιστικού δικτύου έχει ως στόχο την κατάδειξη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μορίων που επηρεάζουν τη μεταγραφή και συχνά μοντελοποιείται ως ένα δίκτυο αποτελούμενο απο κόμβους (που αντιπροσωπεύουν γονίδια, πρωτεΐνες ή/και μεταβολίτες) και ακμές (που αντιπροσωπεύουν μοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών ή/και μεταξύ DNA και πρωτεϊνών ή άλλες έμμεσες σχέσεις μεταξύ γονιδίων).Η κατασκευή των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων ενισχύθηκε ιδιαίτερα ύστερα απο τη πρόοδο που εμφάνισαν οι τεχνολογίες υψηλής απόδοσης, οι οποίες επέτρεψαν τη μέτρηση της συνολικής απόκρισης ενός βιολογικού συστήματος σε διάφορες περιπτώσεις. Για την κατασκευή τους, χρησιμοποιούνται δεδομένα απο πειράματα γονιδιωματικής (genomics), μεταγραφομικής (transcriptomics), πρωτεομικής (proteomics) και μεταβολομικής (metabolomics) καθώς και πληροφορίες απο τη διεθνή βιβλιογραφία όσον αφορά παλαιότερες μελέτες. Με τη χρήση κατάλληλων υπολογιστικών εργαλείων- προγραμμάτων επιτυγχάνεται η διαχείριση, η μελέτη, η ανάλυση και η οπτικοποίηση των διαφορετικών τύπων πληροφοριών

Τα υπολογιστικά μοντέλα που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση των ρυθμιστικών δικτύων μπορούν να διακριθούν σε τρεις κατηγορίες, στα λογικά, στα συνεχή και στα στοχαστικά μοντέλα.

Λογικά Μοντέλα

Περιγράφουν ποιοτικά τα ρυθμιστικά δίκτυα και επιτρέπουν στο χρήστη να κατανοήσει τις διαφορετικές λειτουργίες ενός δεδομένου δικτύου κάτω από διαφορετικές συνθήκες. Η ποιοτική τους φύση τα κάνει πιο εύχρηστα και προσιτά στις βιολογικές ερμηνείες, ωστόσο μπορούν να απαντήσουν μόνο σε ποιοτικές ερωτήσεις! Τα λογικά μοντέλα εισήχθησαν από τους Kauffman και Thomas. Παρουσιάζουν τις θέσεις κάθε κόμβου (γονιδίου - πρωτεΐνης - μικρών μορίων) στο δίκτυο κάθε χρονική στιγμή ως διακριτό επίπεδο. Η χρονική ανάπτυξη-εξέλιξη του εκάστοτε δικτύου θεωρείται ότι γίνεται ταυτόχρονα μέσα από διακριτά χρονικά στάδια. Οι κόμβοι-οντότητες του κάθε δικτύου θεωρείται ότι εισάγονται σε κάθε στάδιο σύμφωνα με τις ρυθμιστικές λειτουργίες που επιτελούνται στο δίκτυο. Οι τύποι δικτύων που σχεδιάστηκαν και ερμηνεύουν τα λογικά μοντέλα είναι οι ακόλουθοι:

• Boolean networks: Tα Boolean δίκτυα χρησιμοποιούν διπλές μεταβλητές xi ∈ {0, 1} για κάθε κόμβο του δικτύου και καθορίζουν έτσι την κατάσταση στην οποία βρίσκεται το εκάστοτε γονίδιο-i μέσα στο δίκτυο, δηλαδή εάν βρίσκεται σε ενεργή κατάσταση (on-1) ή ανενεργή κατάσταση (off -0). Ωστόσο τα Boolean δίκτυα δε μπορούν να επεξηγήσουν ακριβώς τη λειτουργία ενός γονιδίου καθώς αυτό δε βρίσκεται μόνο σε δύο καταστάσεις μέσα στο κύτταρο.,
• Probalistic Boolean networks: O Shmulevich και οι συνεργάτες του τροποποίησαν τα Boolean δίκτυα έτσι ώστε κάθε οντότητα-γονίδιο μέσα στο δίκτυο να έχει περισσότερες από δύο ρυθμιστικές λειτουργίες. Έτσι κάθε φορά ένα εκάστοτε γονίδιο μπορεί να αναλαμβάνει διάφορες ρυθμιστικές λειτουργίες μέσα στο δίκτυο ανάλογα με την πιθανότητα που έχει πάρει από προηγούμενα δεδομένα.
• MetaReg: Σε αυτόν τον τύπο δικτύων κάθε οντότητα μέσα στο δίκτυο που έχει αρκετά επίπεδα συνδεσιμότητας (3-5 συνήθως) και πολλές ρυθμιστικές λειτουργίες είναι διακριτή μέσα στο δίκτυο.
• Petri nets: Είναι μη ντεντερμινιστικά μοντέλα και χρησιμοποιούνται κυρίως για την ανάλυση μεγάλων μεταβολικών δικτύων.

Συνεχή Μοντέλα

Σε αντίθεση με τα λογικά μοντέλα, τα συνεχή μοντέλα χρησιμοποιούν τις πραγματικές τιμές των παραμέτρων σε ένα συνεχές χρονικό πλαίσιο, έτσι ώστε να επιτρέπεται μια συνεχής σύγκριση των προβλέψεων με τα πειραματικά δεδομένα και έτσι η μοντελοποίηση να είναι πιο ακριβής. Τα συνεχή μοντέλα είναι τα ακόλουθα:

• Continuous linear models: σε αυτά τα μοντέλα η αλλαγή του βαθμού μιας οντότητας εξαρτάται από το γραμμικό σταθμισμένο άθροισμα των βαθμών που έχουν οι οντότητες που ρυθμίζουν την οντότητα που μας ενδιαφέρει! Αυτά τα μοντέλα δεν απαιτούν εκτεταμένη γνώση των ρυθμιστικών μηχανισμών και έτσι χρησιμοποιούνται κυρίως για την ποιοτική ερμηνεία των ρυθμιστικών δικτύων.
• Models of transription factor activity: Ο Nachman και οι συνεργάτες του δημιούργησαν το συγκεκριμένο τύπο μοντέλου στο οποίο οι οντότητες μπορεί να είναι γονίδια ή μεταγραφικοί παράγοντες και οι βαθμοί των οντοτήτων αντιπροσωπεύουν τη συγκέντρωση του μεταγράφου ή των μεταγραφικών παραγόντων! Οι ρυθμιστικοί παράγοντες είναι αποκλειστικά μεταγραφικοί παράγοντες σε αυτό το μοντέλο, Έτσι ο βαθμός των γονιδίων καθορίζεται από μη-γραμμικές ρυθμιστικές λειτουργίες που παίρνουν τη μορφή της εξίσωσης Michaelis–Menten. Έτσι ο βαθμός ενός γονιδίου καθορίζεται από την λειτουργία που έχει μέσα στο κύτταρο, αλλά και από το ρυθμό αποικοδόμησης των μεταγράφων του! Επίσης οι παράγοντες χρονοεξαρτώμενης μεταγραφής προκύπτουν από δεδομένα μικροσυστοιχιώ που χρησιμοποιούν μπειζιανά δυναμικά δίκτυα.
• Κανονικές Διαφορικές Εξισώσεις (ODEs),
• Regulated flux balance analysis.

Στοχαστικά Μοντέλα

Τα στοχαστικά μοντέλα (Single-molecule level models) περιγράφουν την σχέση μεταξύ στοχαστικότητας και γονιδιακής ρύθμισης. Όλα τα βιολογικά δίκτυα αποτελούνται από στοχαστικές μονάδες και γι αυτό μπορεί να επιδείξουν διαφορετικές δράσεις ακόμα και αν ξεκίνησαν από ίδιες αρχικές συνθήκες.Όταν οι μονάδες ενός δικτύου είναι λίγες σε αριθμό τότε τό δίκτυο είναι πιο επιρρεπές σε στοχαστικές επιδράσεις.Τα στοχαστικά μοντέλα είναι τα ακόλουθα:

• Gillespie’s stochastic simulation algorithm,
• Approximations to SSA.

Τοπολογία

Η τοπολογία των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων έχει αναλυθεί σε πολλά συστήματα. Στο επίπεδο της αρχιτεκτονικής και της τοπολογίας ενός δικτύου γίνονται διάφορες μετρήσεις, όπως ο βαθμός ενός κόμβου(εισερχόμενος, δηλαδή ο αριθμός των ακμών που ξεκινούν απο ένα κόμβο ή εξερχόμενος, δηλαδή ο αριθμός των ακμών που καταλήγουν σε ένα κόμβο), ο συντελεστής ομαδοποίησης, η μέση απόσταση και άλλα. Ενώ οι περισσότεροι κόμβοι εμφανίζουν μικρό βαθμό, υπάρχουν μερικοί που εμφανίζουν ιδιαίτερα μεγάλο βαθμό και ονομάζονται κεντρικοί κόμβοι. Αυτοί μπορεί να είναι είτε μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουν πολλά γονίδια, είτε γονίδια που ρυθμίζονται απο πολλούς μεταγραφικούς παράγοντες. Σε κάθε περίπτωση, οι κεντρικοί κόμβοι θεωρούνται υψίστης σημασίας για την αρχιτεκτονική του δικτύου. Τα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα δεν είναι τυχαία, όπως αποδεικνύεται απο την ύπαρξη κεντρικών κόμβων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πως ο εξερχόμενος βαθμός ενός κόμβου ακολουθεί κατανομή νόμου δύναμης (power-law distribution) ενώ ο εισερχόμενος φαίνεται να είναι πλησιέστερος στην εκθετική κατανομή (exponential distribution) αν και η σημασία αυτής της διαφοράς δεν έχει ακόμα προσδιοριστεί. Τα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα μπορούν επίσης να αναλυθούν και σε επίπεδο υποδικτύων που περιλαμβάνουν μικρό αριθμό κόμβων. Αυτά μπορεί να περιλαμβάνουν βρόγχους αυτορύθμισης, βρόγχους ανάδρασης, βρόγχους μετάδρασης και άλλες δομές. Στην περίπτωση που αυτές εμφανίζονται πιο συχνά απο το αναμενόμενο, αναφέρονται ως μοτίβα δικτύων. Επειδή εμφανίζονται συχνά, τα μοτίβα δικτύων πιθανά αντιπροσωπεύουν δομές που έψουν προσδώσει κάποια πλεονεκτήματα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης.

Αναζήτηση δομικών ενοτήτων μέσω των GRN

Μέσω των τεχνικών ανάλυσης των δεδομένων των υπαρχόντων γενετικών ρυθμιστικών δικτύων γίνεται μια προσπάθεια ενοποίησης και ενσωμάτωσης τους, με σκοπό την ταυτοποίηση βιολογικών “modules” (δομικά στοιχεία ή δομικές ενότητες). Αυτές οι δομικές ενότητες μπορεί να είναι ομάδες μορίων ή αλληλεπιδράσεων ή σε μοριακό επίπεδο ομάδες γονιδίων, γονιδιακών προϊόντων ή μεταβολιτών, οι οποίες μπορεί να είναι λειτουργικά συντονισμένες, να αλληλεπιδρούν με φυσικό τρόπο ή να ρυθμίζουν η μία την άλλη. Υπάρχουν αρκετοί μέθοδοι εύρεσης δομικών ενοτήτων:

• Ταυτοποίηση ενεργών δομικών ενοτήτων: Η ταυτοποίηση δομικών ενοτήτων που είναι ενεργές στο δίκτυο (μεταγραφικά, μεταβολικά κτλ) γίνεται με την υπέρθεση (overlay) δικτύων με δεδομένα από μοριακά πειράματα που ανήκουν στις ομικές τεχνολογίες (πρωτεομική, μεταγραφομική κτλ). Αυτές οι τεχνικές αποτυπώνουν κυτταρικές αποκρίσεις, οπότε είναι δυνατή η αναγνώριση περιοχών του δικτύου που έχουν αυξημένη δραστηριότητα (πχ έκφραση γονιδίων), ανάλογα με την κάθε συνθήκη άρα και ο εντοπισμός των δομικών ενοτήτων. Για την ανάλυση αυτή έχουν χρησιμοποιηθεί αρκετές υπολογιστικές μέθοδοι οι οποίες μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε τρεις κλάσεις: τις μεθόδους εύρεσης σημαντικών περιοχών των δικτύων (SigArSearch, Significant-area-search), τις μεθόδους που χρησιμοποιούν τεχνικές ανάλυσης διάχυσης ροής και διάδοσης δικτύων και τις μεθόδους που λειτουργούν με βάση την ταυτόχρονη ομαδοποίηση των αλληλεπιδράσεων του δικτύου και των συνθηκών που αυτές οι αλληλεπιδράσεις είναι ενεργές υπό τη σκοπιά της αμφι-ομαδοποίησης (biclustering).
• Ταυτοποίηση συντηρημένων δομικών ενοτήτων: Υπάρχουν τρεις προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση συντηρημένων δομικών ενοτήτων μεταξύ ειδών . Η πρώτη είναι μέσω στοίχισης δικτύων κατά ζεύγη, η οποία όμως επιτρέπει παράλληλες συγκρίσεις μόνο μεταξύ απλών ευθύγραμμων μονοπατιών ή υπό-δικτύων. Η δεύτερη είναι μέσω παράλληλης στοίχισης πολλών δικτύων. Η προσέγγιση αυτή έχει σταδιακά επεκταθεί και για σύγκριση μεταξύ παραπάνω από δύο δικτύων, αλλά έχει ακόμα προβλήματα με την αντιστοίχιση δομικών ενοτήτων. Αυτό συμβαίνει γιατί χρησιμοποιούνται αντιστοιχίσεις μεταξύ ορθόλογων γονιδίων από το κάθε είδος (με βάση την αλληλουχία), ενώ πολλά είδη έχουν αλληλουχίες που προέρχονται από διπλασιασμό γονιδίων, γεγονός που κάνει την ανάλυση αυτή πιο πολύπλοκη Η τελευταία προσέγγιση της ταυτοποίησης συντηρημένων δομικών ενοτήτων έχει να κάνει με στοίχιση δικτύων χρησιμοποιώντας στοιχεία εξελικτικής δυναμικής όπως γονιδιακές ενθέσεις, ελλείψεις ή διπλασιασμούς, κάτι που μπορεί να αποτυπώσει τις γενετικές τροποποιήσεις σε βάθος χρόνου.
• Ταυτοποίηση διαφορικών δομικών ενοτήτων: Ένα μειονέκτημα των δικτύων ήταν ότι τα περισσότερα αποτύπωναν μία στατική κατάσταση του οργανισμού υπό συγκεκριμένες συνθήκες. Αυτό όμως αποτύγχανε να αποτυπώσει τους πολύπλοκους μηχανισμούς που έχει το κύτταρο για να ανταπεξέλθει σε διαφορετικούς παράγοντες. Κάτι τέτοιο μπορεί να λυθεί αν γίνει μία στοίχιση μεταξύ δύο καταστάσεων του ίδιου δικτύου. Σε αυτού του τύπου τη στοίχιση μπορούν να αφαιρεθούν αλληλεπιδράσεις κόμβων που παραμένουν ίδιες μεταξύ των δύο καταστάσεων και να χρησιμοποιηθούν ως κατώφλι για την ανίχνευση δομικών ενοτήτων που διαφέρουν ανά την περίσταση, κάτι που μπορεί να βοηθήσει στην αναγνώριση ασθενών αλληλεπιδράσεων, οι οποίες δεν μπορούν να ανιχνευθούν από τα “στατικά” δίκτυα που προήλθαν από μία κατάσταση.
• Ταυτοποίηση σύνθετων λειτουργικών δομικών ενοτήτων: Οι προσεγγίσεις για την ανάλυση δικτύων και αλληλεπιδράσεων, καθώς και για την ταυτοποίηση δομικών ενοτήτων συνήθως περιγράφουν μόνο ένα μέρος από την λειτουργική αρχιτεκτονική του κυττάρου, όπως αντιδράσεις μεταξύ δύο πρωτεϊνών ή μεταβολικών μονοπατιών. Για να γίνει καλύτερη η αποτύπωση όλων των σύνθετων διεργασιών που μπορεί να έχει μια δομική ενότητα ενός δικτύου πρέπει να ενοποιηθούν δεδομένα από βιολογικές αλληλεπιδράσεις πολλών τύπων σε ένα δίκτυο. Η ανακάλυψη σύνθετων λειτουργικών δομικών ενοτήτων μπορεί να βοηθήσει στην κατανόηση πολλών λειτουργιών του κυττάρου, όπως τις φυσικές και γενετικές αλληλεπιδράσεις ή την συσχέτιση μεταξύ μεταγραφικής ρύθμισης και παραγωγής μεταβολιτών.

Βιβλιογραφία

• Michael Hecker , Sandro Lambeck, Susanne Toepfer, Eugene van Someren, Reinhard Guthke, Gene regulatory network inference: Data integration in dynamic models-A review, Biosystems. 2009 Apr;96(1):86-103
• Guy Karlebach, Ron Shamir, Modelling and analysis of gene regulatory networks, Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 770-780 (October 2008)
• Lesley T. MacNeil,  Albertha J.M. Walhout, Gene regulatory networks and the role of robustness and stochasticity in the control of gene expression, Genome Res. 2011 May; 21(5): 645–657
• Mitra, K., Carvunis, A. R., Ramesh, S. K., & Ideker, T. (2013). Integrative approaches for finding modular structure in biological networks, Nature Reviews Genetics, 14(10), 719-732.

Σύνδεσμοι

• [1]