Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

A strip of eight PCR tubes, each tube contains a 100μl reaction.

Αρχείο:Pcr machine.jpg

Figure 1: A thermal cycler for PCR

Cloning a gene using a plasmid.
(1) Chromosomal DNA of organism A. (2) PCR. (3) Multiple copies of a single gene from organism A. (4) Insertion of the gene into a plasmid. (5) Plasmid with gene from organism A. (6) Insertion of the plasmid in organism B. (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B.

Figure 4: Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments. (1) Father. (2) Child. (3) Mother. The child has inherited some, but not all of the fingerprint of each of its parents, giving it a new, unique fingerprint.

Η Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (ή PCR – polymerase chain reaction) είναι μία τεχνική βιοχημείας και Μορικής Βιολογίας για την απομόνωση και τον πολλαπλασιασμό αλληλουχίας DNA, μέσς της ενζυμικής αναπαραγωγής του DNA χωρίς τη χρήση ζωντανών μικροοργανισμών όπως η E. coli ή οι ζύμες). Η PCR είναι μία in vitro μέθοδος και μπορεί να πραγματοποιηθεί χωρίς περιορισμούς στη μορφή του χρησιμοποιούμενου DNA, και μπορεί να διαφοροποιειθεί εκτενώς για τν πραγματοποίηση πολλών μεθόδων γενετικής επέμβασης. Συγκεκριμένα DNA θραύσματα μπορούν να κλωνοποιηθούν σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα (απουσία ζωντανών κυττάρων) με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR).

Η αντίδραση

Με την PCR μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέχρι και δισεκατομμύρια φορές, δεδομένου ότι είναι γνωστή η νουκλεοτιδική του αλληλουχία. Η αλληλουχία του γονιδίου (ή DNA θραύσματος) είναι απαραίτητη για το σχεδιασμό των συνθετικών DNA ολιγονουκλεοτιδίων το καθένα συμπληρωματικό με μία από τις αλυσίδες του δίκλωνου DNA. Τα ολιγονουκλεοτίδια που θα χρησιμοποιηθούν ως εκκινητήρες πρέπει να δεσμεύονται σε θέσεις αντίθετες από την αλληλουχία που πρόκειται να ενισχυθεί, με άλλα λόγια καθορίζουν τα άκρα του DNA θραύσματος που πρόκειται να ενισχυθεί.

Στάδια

Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια:

• Αποδιάταξη του DNA (denaturation)
• Προσαρμογή των εκκινητήρων στο DNA εκμαγείο (annealing)
• Επιμήκυνση των εκκινητήρων (extension).

Ένας πλήρης τέτοιος κύκλος περιλαμβάνει επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες και γίνεται στις μέρες μας αυτόματα από ειδικά μηχανήματα (thermal cyclers). Σε μια τυπική αντίδραση, το δίκλωνο DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση στους 95° C. Στη συνέχεια οι εκκινητήρες σε περίσσια προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπληρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με ψύξη του δείγματος στους 50 – 60° C. Ακολουθεί επώαση στους 72° C για την επιμήκυνση των εκκινητήρων από μία θερμοάντοχη πολυμεράση, παρουσία των τεσσάρων νουκλεοτιδίων.

Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται, οι νεοσύστατοι κλώνοι με τη σειρά τους χρησιμοποιούνται ως εκμαγεία για την in vitro σύνθεση του DNA. Μετά από μερικούς κύκλους το επικρατές προϊόν είναι ένα DNA θραύσμα που το μέγεθος του οποίου αντιστοιχεί στην μεταξύ των δύο αρχικών εκκινητήρων απόσταση. Στη πράξη 20 με 30 κύκλοι της αντίδρασης είναι αρκετοί για την αποτελεσματική ενίσχυση του DNA θραύσματος. Σε κάθε κύκλο που διαρκεί περίπου πέντε λεπτά η ποσότητα του DNA διπλασιάζεται. Η όλη διαδικασία κλωνοποίησης ενός DNA θραύσματος σε ένα in vitro σύστημα (χωρίς κύτταρα) διαρκεί μερικές ώρες, σε σχέση με τις μερικές μέρες που απαιτούνται για τις in vivo διαδικασίες κλωνοποίησης.

Χρήσεις

Η PCR είναι εξαιρετικά επιλεκτική και ευαίσθητη μέθοδος, έχει δυνατότητα ανίχνευσης και ενός μόνο DNA μορίου σε ένα μείγμα. Μικροποσότητες RNA μπορούν επίσης να αναλυθούν με τον ίδιο τρόπο, μετά τη μεταγραφή τους σε DNA από την ανάστροφη τρανσκριπτάση (RT-PCR – reverse transcription PCR). Η PCR τεχνολογία αντικαθιστά τον υβριδισμό κατά Southern για τη διάγνωση γενετικών ασθενειών και για την ανίχνευση λοιμωδών νόσων (ιώσεων, μικροβιακών λοιμώξεων κτλ.). Επιπλέον, στην ιατροδικαστική από ένα απλό ίχνος αίματος ή άλλων ιστών (ακόμα και από ένα κύτταρο) μπορεί να αναγνωριστεί η ταυτότητα ενός ατόμου (γενετικό αποτύπωμα – genetic “fingerprint”).

Εξωτερικοί σύνδεσμοι

• PCR at Home - Amateur Scientist article in the July 2000 issue of Scientific American on performing PCR reactions with low-cost household materials.
• US Patent for PCR
• Narrated animation and step-through animation of PCR - From the educational multimedia company Sumanas. Adobe Flash required.
• Step-through animation of PCR - From Cold Spring Harbor's Dolan DNA Learning Center. Adobe Flash required.