Σύνθεση DNA
Σύνθεση DNA (DNA synthesis) είναι η φυσική ή τεχνητή δημιουργία μορίων DNA (δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος). Το DNA είναι ένα μακρομόριο που αποτελείται από νουκλεοτιδικές μονάδες, οι οποίες συνδέονται με ομοιοπολικούς δεσμούς και δεσμούς υδρογόνου, σε επαναλαμβανόμενη δομή. Η σύνθεση του DNA συμβαίνει όταν αυτές οι μονάδες νουκλεοτιδίων ενώνονται για να σχηματίσουν DNA. Αυτό μπορεί να συμβεί τεχνητά (in vitro) ή φυσικά (in vivo). Οι μονάδες νουκλεοτιδίων αποτελούνται από μια αζωτούχο βάση (κυτοσίνη, γουανίνη, αδενίνη ή θυμίνη), σάκχαρο πεντόζης (δεοξυριβόζη) και φωσφορική ομάδα. Κάθε μονάδα ενώνεται όταν σχηματίζεται ένας ομοιοπολικός δεσμός μεταξύ της φωσφορικής της ομάδας και του σακχάρου πεντόζης του επόμενου νουκλεοτιδίου, σχηματίζοντας έναν σκελετό σακχάρου-φωσφορικού. Το DNA είναι μια συμπληρωματική, δίκλωνη δομή καθώς το συγκεκριμένο ζεύγος βάσεων (αδενίνη και θυμίνη, γουανίνη και κυτοσίνη) συμβαίνει φυσικά όταν σχηματίζονται δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των βάσεων νουκλεοτιδίου. Υπάρχουν αρκετοί διαφορετικοί ορισμοί για τη σύνθεση DNA: μπορεί να αναφέρεται σε αντιγραφή DNA - βιοσύνθεση DNA (ενίσχυση DNA στη φύση), αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης - ενζυματική σύνθεση DNA (ενίσχυση DNA τεχνητά), ή σύνθεση γονιδίου - δημιουργία γονιδίου με τεχνητές γονιδιακές αλληλουχίες. Αν και κάθε τύπος σύνθεσης είναι πολύ διαφορετικός, μοιράζονται ορισμένα χαρακτηριστικά. Τα νουκλεοτίδια που έχουν ενωθεί για να σχηματίσουν πολυνουκλεοτίδια μπορούν να λειτουργήσουν ως εκμαγεία DNA για να συμβεί μία μορφή σύνθεσης DNA - PCR. Η αντιγραφή του DNA λειτουργεί επίσης χρησιμοποιώντας ένα εκμαγείο DNA, η διπλή έλικα του DNA ξετυλίγεται κατά τη διάρκεια της αντιγραφής, εκθέτοντας ασύζευκτες βάσεις για νέους δεσμούς υδρογόνου σε νουκλεοτίδια. Η γονιδιακή σύνθεση, ωστόσο, δεν απαιτεί εκμαγείο DNA και τα γονίδια συναρμολογούνται εξαρχής. Η σύνθεση DNA συμβαίνει σε όλους τους ευκαρυώτες και προκαρυώτες, καθώς και σε ορισμένους ιούς. Η ακριβής σύνθεση του DNA είναι σημαντική για την αποφυγή μεταλλάξεων στο DNA. Στους ανθρώπους, οι μεταλλάξεις θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε ασθένειες όπως ο καρκίνος. Γι' αυτό, η σύνθεση DNA και ο μηχανισμός που εμπλέκεται στη φύση έχει μελετηθεί εκτενώς κατά τη διάρκεια των δεκαετιών. Στο μέλλον, αυτές οι μελέτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη τεχνολογιών που περιλαμβάνουν σύνθεση DNA, που θα χρησιμοποιηθούν στην αποθήκευση δεδομένων.
Αντιγραφή DNA
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]
Στη φύση, τα μόρια του DNA συντίθενται από όλα τα ζωντανά κύτταρα μέσω της διαδικασίας αντιγραφής του DNA. Αυτό συμβαίνει συνήθως ως μέρος της κυτταρικής διαίρεσης. Η αντιγραφή του DNA συμβαίνει έτσι, κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης, κάθε θυγατρικό κύτταρο περιέχει ένα ακριβές αντίγραφο του γενετικού υλικού του κυττάρου. Η ζωντανή σύνθεση του DNA (αντιγραφή του DNA) εξαρτάται από ένα σύνθετο σύνολο ενζύμων που έχουν εξελιχθεί για να δρουν κατά τη φάση S του κυτταρικού κύκλου, με συντονισμένο τρόπο. Και στους ευκαρυώτες και στους προκαρυώτες, η αντιγραφή του DNA συμβαίνει όταν συγκεκριμένες τοποϊσομεράσες, ελικάσες και γυράσες (πρωτεΐνες εκκίνησης αντιγραφής) Το δίκλωνο DNA ξετυλίγεται, εκθέτοντας τις αζωτούχες βάσεις.[1] Αυτά τα ένζυμα, μαζί με τις βοηθητικές πρωτεΐνες, σχηματίζουν μια μακρομοριακή μηχανή που εξασφαλίζει ακριβή διπλασιασμό των αλληλουχιών του DNA. Πραγματοποιείται συμπληρωματική σύζευξη βάσεων, σχηματίζοντας ένα νέο δίκλωνο μόριο DNA. Αυτό είναι γνωστό ως ημισυντηρητική αντιγραφή αφού ένας κλώνος του νέου μορίου του DNA προέρχεται από τον γονικό κλώνο. Τα ευκαρυωτικά ένζυμα αντιμετωπίζουν συνεχώς βλάβη στο DNA που μπορεί να διαταράξει την αντιγραφή του DNA. Αυτή η βλάβη έχει τη μορφή αλλοιώσεων του DNA που προκύπτουν αυθόρμητα ή λόγω παραγόντων που βλάπτουν το DNA. Ως εκ τούτου, ο μηχανισμός αντιγραφής του DNA είναι εξαιρετικά ελεγχόμενος προκειμένου να αποφευχθεί η κατάρρευση όταν αντιμετωπίζεται ζημιά.[2] Ο έλεγχος του συστήματος αντιγραφής του DNA διασφαλίζει ότι το γονιδίωμα αντιγράφεται μόνο μία φορά ανά κύκλο. Η υπερβολική αντιγραφή προκαλεί βλάβη στο DNA. Η απορρύθμιση της αντιγραφής του DNA είναι ένας βασικός παράγοντας της γονιδιωματικής αστάθειας κατά την ανάπτυξη του καρκίνου.[3] Αυτό υπογραμμίζει την εξειδίκευση του μηχανισμού σύνθεσης του DNA "στη φύση". Υπάρχουν διάφορα μέσα για την τεχνητή διέγερση της αντιγραφής του φυσικού DNA ή για τη δημιουργία τεχνητών αλληλουχιών γονιδίων. Ωστόσο, η σύνθεση DNA "στο εργαστήριο" μπορεί να είναι μια διαδικασία πολύ επιρρεπής σε σφάλματα.
Σύνθεση επιδιόρθωσης DNA
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]Το κατεστραμμένο DNA υπόκειται σε επιδιόρθωση από πολλές διαφορετικές ενζυματικές διαδικασίες επιδιόρθωσης, όπου κάθε μεμονωμένη διαδικασία είναι εξειδικευμένη για την επιδιόρθωση συγκεκριμένων τύπων βλάβης. Το DNA των ανθρώπων υπόκειται σε βλάβη από πολλαπλές φυσικές πηγές και η ανεπαρκής επιδιόρθωση σχετίζεται με ασθένειες και πρόωρη γήρανση.[4] Οι περισσότερες διεργασίες επιδιόρθωσης του DNA σχηματίζουν μονόκλωνα κενά στο DNA κατά τη διάρκεια ενός ενδιάμεσου σταδίου της επιδιόρθωσης και αυτά τα κενά συμπληρώνονται με σύνθεση επιδιόρθωσης.[4] Οι συγκεκριμένες διεργασίες επιδιόρθωσης που απαιτούν πλήρωση κενού με σύνθεση DNA περιλαμβάνουν επιδιόρθωση εκτομής νουκλεοτιδίων, επιδιόρθωση εκτομής βάσης, επιδιόρθωση ασυμφωνίας, επιδιόρθωση ομόλογου ανασυνδυασμού, σύνδεση μη ομόλογου άκρου και σύνδεση άκρου με μεσολάβηση μικροομολογίας.
Αντίστροφη μεταγραφή
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]Η αντίστροφη μεταγραφή είναι μέρος του κύκλου αντιγραφής συγκεκριμένων οικογενειών ιών, συμπεριλαμβανομένων των ρετροϊών. Περιλαμβάνει αντιγραφή του RNA σε δίκλωνο συμπληρωματικό DNA (cDNA), χρησιμοποιώντας ένζυμα αντίστροφης μεταγραφάσης. Στους ρετροϊούς, το ιικό RNA εισάγεται στον πυρήνα του κυττάρου ξενιστή. Εκεί, ένα ιικό ένζυμο αντίστροφης μεταγραφάσης προσθέτει νουκλεοτίδια DNA στην αλληλουχία RNA, δημιουργώντας cDNA που εισάγεται στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή από το ένζυμο ολοκληράση, που κωδικοποιεί τις ιικές πρωτεΐνες.[5]
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]
Μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια μορφή ενζυματικής σύνθεσης DNA στο εργαστήριο, χρησιμοποιώντας κύκλους επαναλαμβανόμενης θέρμανσης και ψύξης της αντίδρασης για τήξη του DNA και ενζυματική αντιγραφή του DNA. Η σύνθεση DNA κατά τη διάρκεια της PCR είναι πολύ παρόμοια με τα ζωντανά κύτταρα αλλά έχει πολύ συγκεκριμένα αντιδραστήρια και συνθήκες. Κατά τη διάρκεια της PCR, το DNA εξάγεται χημικά από τις πρωτεΐνες συνοδείας του ξενιστή και στη συνέχεια θερμαίνεται, προκαλώντας θερμική διάσταση των κλώνων του DNA. Δύο νέοι κλώνοι cDNA δημιουργούνται από τον αρχικό κλώνο, αυτοί οι κλώνοι μπορούν να διαχωριστούν ξανά για να λειτουργήσουν ως εκμαγείο για περαιτέρω προϊόντα PCR. Το αρχικό DNA πολλαπλασιάζεται με πολλούς γύρους PCR.[1] Μπορούν να δημιουργηθούν περισσότερα από ένα δισεκατομμύριο αντίγραφα του αρχικού κλώνου DNA.
Τυχαία μεταλλαξιογένεση
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]Για πολλά πειράματα, όπως δομικές και εξελικτικές μελέτες, οι επιστήμονες πρέπει να δημιουργήσουν μια μεγάλη βιβλιοθήκη παραλλαγών μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA. Η τυχαία μεταλλαξιογένεση λαμβάνει χώρα στο εργαστήειο, όταν η μεταλλαξιογόνος αντιγραφή με μια πολυμεράση DNA χαμηλής πιστότητας συνδυάζεται με επιλεκτική ενίσχυση PCR για την παραγωγή πολλών αντιγράφων μεταλλάγματος DNA.[6]
RT-PCR
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]Η RT-PCR διαφέρει από τη συμβατική PCR καθώς συνθέτει cDNA από mRNA και όχι από εκμαγείο DNA. Η τεχνική συνδυάζει μια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής με ενίσχυση που βασίζεται σε PCR, καθώς μια αλληλουχία RNA δρα ως εκμαγείο για το ένζυμο, την αντίστροφη μεταγραφάση. Η RT-PCR χρησιμοποιείται συχνά για τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης σε συγκεκριμένους τύπους ιστών ή κυττάρων σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια ή για τον έλεγχο γενετικών διαταραχών.[7]
Γονιδιακή σύνθεση
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]Η τεχνητή γονιδιακή σύνθεση είναι η διαδικασία σύνθεσης ενός γονιδίου in vitro χωρίς την ανάγκη αρχικών δειγμάτων εκμαγείου DNA. Το 2010 ο J. Ο Craig Venter και η ομάδα του ήταν οι πρώτοι που χρησιμοποίησαν εξ ολοκλήρου συνθεμένο DNA για να δημιουργήσουν ένα αυτοαναπαραγόμενο μικρόβιο, που ονομάστηκε Mycoplasma laboratorium.[8]
Σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]Η σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων είναι η χημική σύνθεση αλληλουχιών των νουκλεϊκών οξέων. Η πλειοψηφία της βιολογικής έρευνας και της βιομηχανικής περιλαμβάνει συνθετικό DNA, το οποίο μπορεί να περιλαμβάνει ολιγονουκλεοτίδια, συνθετικά γονίδια ή ακόμη και χρωμοσώματα. Σήμερα, το μεγαλύτερο μέρος του συνθετικού DNA κατασκευάζεται κατά παραγγελία χρησιμοποιώντας τη μέθοδο φωσφοραμιδίτη (phosphoramidite) από τον Marvin H. Caruthers. Τα ολίγονουκλεοτίδια συντίθενται από δομικά στοιχεία που αναπαράγουν φυσικές βάσεις. Άλλες τεχνικές για τη σύνθεση DNA έχουν διατεθεί στο εμπόριο, συμπεριλαμβανομένης της συναρμολόγησης σύντομης απολίνωσης ολιγονουκλεοτιδίων.[9] Η διαδικασία έχει αυτοματοποιηθεί από τα τέλη της δεκαετίας του 1970 και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το σχηματισμό επιθυμητών γενετικών αλληλουχιών καθώς και για άλλες χρήσεις στην ιατρική και τη μοριακή βιολογία. Ωστόσο, η δημιουργία αλληλουχιών χημικά δεν είναι πρακτική πέρα από 200-300 βάσεις και είναι μια διαδικασία επικίνδυνη για το περιβάλλον. Αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια, των περίπου 200 βάσεων, μπορούν να συνδεθούν χρησιμοποιώντας μεθόδους συναρμολόγησης DNA, δημιουργώντας μεγαλύτερα μόρια DNA.[10] Ορισμένες μελέτες έχουν διερευνήσει τη δυνατότητα ενζυματικής σύνθεσης χρησιμοποιώντας ακροτελική δεοξυνουκλεοτιδυλική μεταφοράση (terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT), μια DNA πολυμεράση που δεν απαιτεί εκμαγείο. Ωστόσο, αυτή η μέθοδος δεν είναι ακόμη τόσο αποτελεσματική όσο η χημική σύνθεση και δεν είναι διαθέσιμη στο εμπόριο.[11] Με την πρόοδο στην τεχνητή σύνθεση DNA, διερευνάται η δυνατότητα αποθήκευσης δεδομένων DNA. Με την εξαιρετικά υψηλή πυκνότητα αποθήκευσης και τη μακροπρόθεσμη σταθερότητά, το συνθετικό DNA είναι μια ενδιαφέρουσα επιλογή για την αποθήκευση μεγάλων ποσοτήτων δεδομένων. Αν και οι πληροφορίες μπορούν να ανακτηθούν πολύ γρήγορα από το DNA μέσω τεχνολογιών προσδιορισμού αλληλουχίας επόμενης γενιάς, η εκ νέου σύνθεση του DNA είναι ένα σημαντικό εμπόδιο στη διαδικασία. Μόνο ένα νουκλεοτίδιο μπορεί να προστεθεί ανά κύκλο, με κάθε κύκλο να διαρκεί δευτερόλεπτα, επομένως η συνολική σύνθεση είναι πολύ χρονοβόρα, καθώς και πολύ επιρρεπής σε σφάλματα. Ωστόσο, εάν βελτιωθεί η βιοτεχνολογία, το συνθετικό DNA θα μπορούσε μια μέρα να χρησιμοποιηθεί στην αποθήκευση δεδομένων.[12]
Σύνθεση ζεύγους βάσεων
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]Έχει αναφερθεί ότι μπορούν να συντεθούν νέα ζεύγη νουκλεοβάσης, καθώς και A-T (αδενίνη - θυμίνη) και G-C (γουανίνη - κυτοσίνη). Τα συνθετικά νουκλεοτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να επεκτείνουν το γενετικό αλφάβητο και να επιτρέψουν ειδική τροποποίηση θέσεων DNA. Ακόμη και ένα τρίτο ζεύγος βάσεων θα επέκτεινε τον αριθμό των αμινοξέων που μπορούν να κωδικοποιηθούν από το DNA από τα υπάρχοντα 20 αμινοξέα σε πιθανά 172.[8] Το Hachimoji DNA αποτελείται από οκτώ γράμματα νουκλεοτιδίων, σχηματίζοντας τέσσερα πιθανά ζεύγη βάσεων. Επομένως διπλασιάζει την πυκνότητα πληροφοριών του φυσικού DNA. Σε μελέτες, το RNA έχει παραχθεί ακόμη και από hachimoji DNA. Αυτή η τεχνολογία θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί για να επιτρέψει την αποθήκευση δεδομένων στο DNA.[13]
Παραπομπές
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]- ↑ 1,0 1,1 Pelt-Verkuil, Evan (2008). «A Brief Comparison Between in Vivo DNA Replication and in Vitro PCR Amplification». Principles and Technical Aspects of PCR Amplification (PDF). Rotterdam: Springer Netherlands. σελίδες 9–15. doi:10.1007/978-1-4020-6241-4_2. ISBN 978-1-4020-6240-7. Unknown parameter
|s2cid=ignored (βοήθεια) - ↑ Patel, Darshil R.; Weiss, Robert S. (2018). «A tough row to hoe: when replication forks encounter DNA damage». Biochem Soc Trans 46 (6): 1643–1651. doi:. PMID 30514768.
- ↑ Reusswig, Karl-Uwe; Pfander, Boris (2019). «Control of Eukaryotic DNA replication Initiation - Mechanisms to Ensure Smooth Transitions». Genes (Basel) 10 (2): 99. doi:. PMID 30700044.
- ↑ 4,0 4,1 Tiwari V, Wilson DM 3rd. DNA Damage and Associated DNA Repair Defects in Disease and Premature Aging. Am J Hum Genet. 2019 Aug 1;105(2):237-257. doi: 10.1016/j.ajhg.2019.06.005. Review. PMID 31374202
- ↑ Hughes, Stephen H (2015). «Reverse Transcription of Retroviruses and LTR Retrotransposons». Microbiology Spectrum 3 (2): 1051–1077. doi:. ISBN 9781555819200. PMID 26104704.
- ↑ Forloni, M (2018). «Random Mutagenesis Using Error-prone DNA Polymerases.». Cold Spring Harbor Protocols 2018 (3): pdb.prot097741. doi:. PMID 29496818.
- ↑ Bachman, Julia (2013). Chapter Two - Reverse-Transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530. σελίδες 67–74. doi:10.1016/B978-0-12-420037-1.00002-6. PMID 24034314.
- ↑ 8,0 8,1 Fikes, Bradley J. (May 8, 2014). «Life engineered with expanded genetic code». San Diego Union Tribune. Αρχειοθετήθηκε από το πρωτότυπο στις 9 May 2014. https://web.archive.org/web/20140509001048/http://www.utsandiego.com/news/2014/may/08/tp-life-engineered-with-expanded-genetic-code/. Ανακτήθηκε στις 8 May 2014.
- ↑ https://telesisbio.com/gibson-sola-platform/
- ↑ Palluk, Sebastian; Arlow, Daniel H (2018). «De novo DNA synthesis using polymerase-nucleotide conjugates». Nature Biotechnology 36 (7): 645–650. doi:. PMID 29912208.
- ↑ Perkel, Jeffrey M. (2019). «The race for enzymatic DNA synthesis heats up». Nature 566 (7745): 565. doi:. PMID 30804572. Bibcode: 2019Natur.566..565P.
- ↑ Tabatabaei, S. Kasra (2020). «DNA punch cards for storing data on native DNA sequences via enzymatic nicking». Nature Communications 11 (1): 1742. doi:. PMID 32269230. Bibcode: 2020NatCo..11.1742T.
- ↑ Hoshika, Shuichi (2020). «Hachimoji DNA and RNA. A Genetic System with Eight Building Blocks». Science 363 (6429): 884–887. doi:. PMID 30792304.