Μεταμεταγραφική ρύθμιση

Από τη Βικιπαίδεια, την ελεύθερη εγκυκλοπαίδεια
Πήδηση στην πλοήγηση Πήδηση στην αναζήτηση

Η μεταμεταγραφική ρύθμιση αναφέρεται στο σύνολο των διαδικασιών που αφορούν ένα μετάγραφο RNA μετά την παραγωγή του στα ευκαρυωτικά κύτταρα.

Τροποποιήσεις του ευκαρυωτικού mRNA εντός του πυρήνα[1][2][Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Στα ευκαρυωτικά κύτταρα οι τροποποιήσεις στα RNA μετάγραφα ξεκινούν πριν ακόμα από την έξοδό τους από τον πυρήνα. Αυτές οι αντιδράσεις επεξεργασίας είναι στενά συζευγμένες με τη μεταγραφή και πραγματοποιούνται ενόσω μεταγράφεται το RNA. Τα ένζυμα που ευθύνονται για την επεξεργασία του RNA ακολουθούν την ευκαρυωτική RNA πολυμεράση κατά τη διάρκεια της μεταγραφής. Η RNA πολυμεράση ΙΙ (RNAPII), η οποία είναι υπεύθυνη για τη μεταγραφή των mRNA και των μη κωδικών RNA (ncRNAs), περιέχει μία υπομονάδα, την Rpb1, η οποία αποτελείται από 52 επαναλήψεις ενός επταπεπτιδίου (YSPTSPS) (Steinmetz, 1997). Αυτή η περιοχή (domain) δρα ως πλατφόρμα αλληλεπίδρασης για τους παράγοντες που συμμετέχουν στη ρύθμιση της μεταγραφής και στις τέσσερις διεργασίες που σχετίζονται με αυτή: κάλυψη, συρραφή/μάτισμα, πολυαδενυλίωση και τερματισμός.[3] [4] Μόλις το μετάγραφο αναδυθεί από την RNA πολυμεράση, τα ένζυμα επεξεργασίας δεσμεύονται πάνω σε αυτό και το επεξεργάζονται.

Ανάλογα με το είδος του RNA που παράγεται , τα μετάγραφα υποβάλλονται σε διαφορετική κατά περίπτωση επεξεργασία. Δύο είδη επεξεργασίας στα οποία υποβάλλονται μόνο τα μετάγραφα που προορίζονται για mRNA είναι ο σχηματισμός της καλύπτρας και η πολυαδενυλίωση.

Ο σχηματισμός της καλύπτρας περιλαμβάνει μια τροποποίηση του 5’ άκρου του mRNA μεταγράφου, δηλαδή του άκρου που συντίθεται πρώτο κατά τη διάρκεια της μεταγραφής. Το 5’ άκρο καλύπτεται με την προσθήκη ενός νουκλεοτιδίου γουανίνης το οποίο περιέχει μια μεθυλομάδα. Ο σχηματισμός της καλύπτρας συνήθως γίνεται αμέσως μόλις η RNA πολυμεράση συνθέσει περίπου 25 νουκλεοτίδια, δηλαδή πολύ προτού ολοκληρώσει τη μεταγραφή ολόκληρου του γονιδίου.

Η πολυαδενυλίωση παρέχει στα περισσότερα νεοσυντιθέμενα mRNA μετάγραφα μια εξειδικευμένη δομή στο 3’ άκρο. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα τα 3’ άκρα των pre-mRNA μεταγράφων αρχικά βραχύνονται από ένα ένζυμο που κόβει την αλυσίδα του RNA σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Το σημείο αυτό όπου γίνεται το κόψιμο εδράζεται ανάμεσα σε ένα υψηλά συντηρημένο εξαμερές AAUAAA και μία αλληλουχία downstream sequence element (DSE) η οποία είναι πλούσια σε μοτίβα ουρακίλης ή ουρακίλης-γουανίνης. Το κόψιμο πραγματοποιείται σε ένα δινουκλεοτίδιο κυτοσίνης-αδενίνης (CA)[5] και μετά η αλυσίδα ολοκληρώνεται από ένα δεύτερο ένζυμο, το οποίο προσθέτει στο κομμένο άκρο μια σειρά διαδοχικών νουκλεοτιδίων αδενίνης (ουρά πολύ(Α)), που συνήθως έχει μήκος λίγων εκατοντάδων νουκλεοτιδίων.

Οι δύο αυτές τροποποιήσεις θεωρείται ότι χρησιμοποιούνται αργότερα από τον πρωτεϊνοσυνθετικό μηχανισμό ως ένδειξη ότι και τα δύο άκρα του mRNA είναι παρόντα και συνεπώς ότι το μήνυμα είναι πλήρες. Αλλαγές στην 5’ περιοχή της καλύπτρας επιτρέπουν  ασφαλές πέρασμα στο κυτταρόπλασμα ώστε το RNA να προωθηθεί για μετάφραση, παρέχοντας αυξημένη σταθερότητα και προστασία από τις 5’ εξωνουκλεάσες.[5] Επιπλέον, το 5’ κάλυμμα του RNA θεωρείται ότι δρα και αυτό προς την ενίσχυση της μετάφρασης. Επίσης, πρόσφατες μελέτες φανερώνουν ότι οι δομές στο 5’ άκρο (πχ. μεθυλίωση γουανίνης) ενισχύουν τη διάκριση των εγγενών mRNA από αυτά ιικής προέλευσης.[6][7]

Πολλά ευκαρυωτικά γονίδια είναι μωσαϊκά, αποτελούμενα από τμήματα κωδικών αλληλουχιών (εξώνια) διαχωριζόμενα μεταξύ τους από τμήματα μη κωδικών αλληλουχιών (ιντρόνια). Τα μη κωδικά εξόνια περιλαμβάνουν τις 5’ UTRs και 3’ UTRs (μη μεταφραζόμενες περιοχές) ενός mRNA, όλα τα μέρη των συρραμμένων, σταθερών μη κωδικών RNA και περιοχές που δίνουν γένεση σε λειτουργικά RNA όπως τα micro RNAs. Τα διακεκομμένα γονίδια των ευκαρυωτών μεταγράφονται σε ένα μονήρες αντίγραφο RNA ολόκληρου του γονιδίου. Έτσι το πρωτογενές μετάγραφο (pre-mRNA) ενός τυπικού ευκαρυωτικού γονιδίου περιέχει ιντρόνια και εξόνια. Τα ιντρόνια απομακρύνονται από το πρόδρομο mRNA μέσω μιας διαδικασίας η οποία ονομάζεται συρραφή/μάτισμα του RNA (RNA splicing) που μετατρέπει το πρόδρομο mRNA σε ώριμο mRNA. Ορισμένα πρόδρομα mRNA μπορούν να συρραφτούν με περισσότερους του ενός τρόπους, παράγοντας εναλλακτικά mRNA. Αυτή η διαδικασία αναφέρεται ως εναλλακτική συρραφή (alternative splicing) και δίνει γένεση σε προϊόντα-ισομορφές του ίδιου γονιδίου.[8]

Ρύθμιση της εξόδου των RNA μορίων από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Η μεταφορά του mRNA από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα όπου το mRNA μεταφράζεται σε πρωτεΐνη είναι πολύ επιλεκτική καθώς συνδέεται στενά με τη σωστή επεξεργασία του RNA. Αυτή η σύζευξη επιτυγχάνεται από το σύμπλοκο των πυρηνικών πόρων (nucleoporins) το οποίο αναγνωρίζει και μεταφέρει μόνο ολοκληρωμένα mRNA μετάγραφα. Για να είναι έτοιμο για εξαγωγή ένα μόριο mRNA πρέπει να είναι συνδεδεμένο με την κατάλληλη ομάδα πρωτεϊνών. Καθεμία από αυτές τις πρωτεΐνες σηματοδοτεί ότι το mRNA έχει υποβληθεί στη σωστή επεξεργασία: αρχικά πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην προσθήκη καλύπτρας, κατόπιν παράγοντες συρραφής και τέλος τις πρωτεΐνες που μεσολαβούν στην πολυαδενυλίωση. Ο μηχανισμός εξαγωγής από τον πυρήνα φαίνεται να είναι στενά συνδεδεμένος με το μάτισμα του mRNA (splicing). [9]

Η έξοδος των RNA μορίων από τον πυρήνα αποτελεί κομβικό στάδιο της μέτα-μεταγραφικής ρύθμισης. Για την πλειοψηφία των RNA μορίων, όπως τα tRNAs, miRNAs, και UsnRNAs, ως μόριο μεταφορέας χρησιμοποιείται η ιμπορτίνη/καρυοφερίνη-β-τύπου.[10] Αντίθετα, για τα μόρια mRNA χρησιμοποιούνται συνήθως τα ετεροδιμερή  Tap–p15 (ή αλλιώς NXF1–NXT1) στα μετάζωα και Mex67–Mtr2 στον Saccharomyces cerevisiae.[10] Ο μηχανισμός της εξόδου του mRNA είναι εξελικτικά συντηρημένος ανάμεσα στα είδη ζυμομυκήτων και μεταζώων.[10]  Ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιείται και στο επίπεδο της εξόδου των mRNA μορίων από τον πυρήνα, πέρα από το επίπεδο της μεταγραφής και της μετάφρασης. Ομάδες mRNA εμφανίζουν κοινή ρύθμιση, λόγω της ύπαρξης συγκεκριμένων αλληλουχιών στις αμετάφραστες περιοχές τους (UTR), με αποτέλεσμα την συντονισμένη έξοδο τους από τον πυρήνα (RNA regulons). 

Η έξοδος των mRNA μορίων από τον πυρήνα περιλαμβάνει κάποια βασικά στάδια. Αρχικά, απαιτείται η πρόσδεση των κατάλληλων παραγόντων εξόδου πάνω στο mRNA, γεγονός που ξεκινά ήδη από το στάδιο της μεταγραφής. Στη συνέχεια, θα πρέπει το ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο (mRNP) που προκύπτει να “αγκυροβολήσει” στον πυρηνικό πόρο (nuclear pore complex, NPC) και να μεταφερθεί μέσα από τον κεντρικό δίαυλο, προς τα κυτταροπλασματικά ινίδια του. Όπως ήδη αναφέρθηκε η πιο κοινή πρωτεΐνη μεταφορέας που χρησιμοποιείται κατά την έξοδο από τον πυρήνα είναι η NXF1 (Nuclear RNA export factor 1 ή αλλιώς TAP). Συχνά εμφανίζεται και η πρωτεΐνη CRM1, που χρησιμοποιείται κυρίως για την μεταφορά ειδικών mRNA μορίων. Και στις δύο περιπτώσεις χρησιμοποιούνται κάποιες πρωτεΐνες προσαρμογείς, που αυξάνουν την συγγένεια πρόσδεσης των πρωτεϊνών μεταφορέων προς το mRNA.  Μελέτες έχουν δείξει ότι η πρόσδεση ενός mRNA μορίου πάνω στο σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου, δεν συνεπάγεται αυτόματα και την έξοδο αυτού από τον πυρήνα. Υπολογίζεται ότι μόνο το 25%-35% των μορίων που φτάνουν στον πυρηνικό πόρο, εξέρχονται από τον πυρήνα.[11] Το γεγονός αυτό εξαρτάται από την σωστή επεξεργασία και ωρίμανση που έχει υποστεί το mRNA μέχρι να φτάσει στον πυρηνικό πόρο. Για το λόγο αυτό ελαττωματικά mRNA και παραπροϊόντα της ωρίμανσης του RNA, όπως ιντρόνια που προκύπτουν από το μάτισμα, αποικοδομούνται από το σύμπλοκο του εξωσώματος[12].

Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου αποτελείται από 30 διαφορετικές πρωτεΐνες που ονομάζονται νουκλεοπρωτεΐνες (nucleoporins Nups), που διακρίνονται σε 3 κατηγορίες: οι Nups των μεμβρανών που αγκυροβολούν τα NPC στον πυρηνικό φάκελο, οι δομικές Nups και οι FG Nups που περιέχουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες φαινυλαλανίνης και γλυκίνης (FG επαναλήψεις) και τυπικά παίζουν ρόλο στη μεταφορά φορτίων μέσω του κεντρικού διαύλου του πυρηνικού πόρου.[11]

Μεταφορά μέσω της πρωτεΐνης NXF1[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Η πρωτεΐνη NXF1 αποτελείται από πολλαπλές επικράτειες, οι οποίες είναι οι εξής: α) το μοτίβο αναγνώρισης RNA, που επιτρέπει στην πρωτεΐνη να προσδένεται σε μη-ειδικά RNA με μικρή συγγένεια, η οποία αυξάνεται παρουσία πρωτεϊνών προσαρμογέων, όπως η ALY/REF, β) μια επικράτεια πλούσια σε λευκίνη  που σε συνδυασμό με την προηγούμενη επικράτεια συνδέεται σε μοτίβα CTE (constitutive transport element) και γ) δύο ακόμα επικράτειες που επιτρέπουν την μεταφορά των mRNA μέσα από τον κεντρικό αυλό του πυρηνικού πόρου, αλληλεπιδρώντας με τις FG νουκλεοπρωτεΐνες.[11]

Ο κύκλος ζωής ενός ριβονουκλεοπρωτεϊνικού σωματιδίου από την σύνθεση έως την έξοδο του από τον πυρήνα

Το σύμπλοκο TREX (transcription export complex) είναι ένα εξελικτικά συντηρημένο πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο.[10] Αποτελείται από παράγοντες που συμμετέχουν τόσο στη μεταγραφή όσο και στην έξοδο του mRNA από τον πυρήνα[10] και είναι οι εξής: το σύμπλοκο ΤΗΟ (Thoc1/hHpr1, Thoc2, Thoc3/hTEX1, Thoc5/FMIP, Thoc6 και Thoc7) και οι πρωτεΐνες UAP56, ALY/REF και CIP29. Το σύμπλοκο αυτό προσδένεται στο 5’ άκρο των μορίων mRNA, κατά τη διάρκεια του ματίσματος, καθώς και της προσθήκης της καλύπτρας της 7-μεθυλογουανοσίνης. Η πρωτεΐνη NXF1 έχει χαμηλή συγγένεια πρόσδεσης για το mRNA, η οποία αυξάνεται λόγω της πρόσδεσης της στα συστατικά του συμπλόκου TREX.[13] Πιο συγκεκριμένα, κατά τη μαζική έξοδο μορίων mRNA, η πρωτεΐνη NXF1 αλληλεπιδρά με τα νεοσυντιθέμενα mRNA μόρια συνήθως μέσω της πρωτεΐνης προσαρμογέα ALY/REF και πρωτεϊνών του συμπλόκου ΤΗΟ.[11]  Με αυτόν τον τρόπο αλλάζει η διαμόρφωση της πρωτεΐνης, καθιστώντας την επικράτεια δέσμευσης του RNA προσβάσιμη και αυξάνοντας τη συγγένεια πρόσδεσης σε αυτό.[13] Το ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο (mRNP) που προκύπτει μπορεί να “αγκυροβολήσει” στον πυρηνικό πόρο, αλληλεπιδρώντας με τις νουκλεοπορίνες TPR, Nup153, Nup98 και Rae1.[11]  Σύμφωνα με μια άλλη θεωρία το mRNA μεταφέρεται μέσω του συμπλόκου TREX-2 στην πρωτεΐνη NXF1 και στη συνέχεια στον αυλό του πυρηνικού πόρου, όπου και αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη TPR.  Σε κάθε περίπτωση η μεταφορά προχωράει μέσω αλληλεπιδράσεων με τις FG νουκλεοπορίνες. Ο παράγοντας NXF1 συνδέεται και με την Nup62 μέσα στον αυλό του πυρηνικού πόρου. Ο ακριβής μηχανισμός όμως εξόδου, ο οποίος χαρακτηρίζεται από μεγάλη ταχύτητα, δεν είναι ακόμα σαφής. Στην κυτταροπλασματική πλευρά του πυρηνικού πόρου τα μόρια mRNA συνδέονται με τα κυτταροπλασματικά ινίδια, που αποτελούνται κυρίως από τον παράγοντα Nup358/RanBP2. Ο παράγοντας αυτός διαθέτει θέσεις πρόσδεσης για  τις πρωτεΐνες NXF1, RanGAP, Ran και άλλες.  Ένας κρίσιμος παράγοντας που καθορίζει την κατεύθυνση της εξόδου του mRNA είναι η εξαρτώμενη από το ΑΤΡ, RNA ελικάση, DBP5 (επίσης γνωστή ως DDX19B). Η δραστικότητα ΑΤΡάσης της DBP5 καταλύει την απελευθέρωση των πρωτεϊνών που έχουν δεσμευτεί στο mRNA[13]. Η αντίδραση αυτή ρυθμίζεται από 3 πρωτεΐνες: την νουκλεοπορίνη GLE1, το μικρό σηματοδοτικό μόριο της εξαφωσφορικής ινοσιτόλης (InsP6) και την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη του πυρηνικού πόρου NUP214 (Nup159 στους ζυμομύκητες). [13] Απαραίτητη είναι η πρόσδεση της IP6 στην GLE1. Το σύμπλοκο που προκύπτει προωθεί την πρόσδεση της DBP5 στο mRNP, την υδρόλυση ΑΤΡ και την επακόλουθη απελευθέρωση του mRNA στο κυτταρόπλασμα.[11]

Για την μεταφορά ειδικών mRNA μορίων από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα απαιτείται η επιστράτευση διαφορετικών πρωτεϊνών προσαρμογέων. Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη NXF1 μπορεί να σχηματίσει το σύμπλοκο AREX, που περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες CIP29 και DDX39 και χρησιμοποιείται για την μεταφορά mRNA μορίων που σχετίζονται με τη μίτωση. Για τον σχηματισμό αυτών των ειδικών πρωτεϊνικών συμπλόκων απαιτείται η παρουσία ειδικών αλληλουχιών στο mRNA. Παράδειγμα αποτελεί η πρωτεΐνη RBM15, που συμμετέχει στην μεταφορά μορίων με το στοιχείο RTE (RNA transport element). Σε ορισμένες περιπτώσεις, η NXF1 είναι σε θέση να εξάγει μετάγραφα αλληλεπιδρώντας άμεσα με αλληλουχίες RNA, όπως το CTE.[11]

Μεταφορά μέσω της πρωτεΐνης CRM1[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Η δεύτερη βασική πρωτεΐνη που χρησιμοποιείται για την έξοδο μορίων RNA από τον πυρήνα είναι η καρυοφερίνη CRM1. Πιο συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη αυτή προσδένεται άμεσα στον πυρηνικό πόρο και παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταφορά μικρών πυρηνικών μορίων RNA, ριβοσωμικών RNA, καθώς και μιας ειδικής ομάδας ώριμων mRNA μορίων. Παράλληλα, δεν προσδένεται άμεσα πάνω στα μόρια RNA που μεταφέρει, αλλά σε πρωτεΐνες προσαρμογείς, που διαθέτουν σήματα εξόδου από τον πυρήνα, πλούσια σε λευκίνη. Η συγγένεια πρόσδεσης αυξάνεται μόνο με την παρουσία της Ran-GTP. Η πρωτεΐνη αυτή καθορίζει και την κατεύθυνση μεταφοράς των mRNA φορτίων από ή προς τον πυρήνα. Για την απελευθέρωση του mRNA-φορτίου, από τη CRM1 στο κυτταρόπλασμα, είναι απαραίτητη η υδρόλυση του GTP της RAN-GTP. Η αντίδραση αυτή πραγματοποιείται από την πρωτεΐνη RanGAP (Ran GTPase activating protein) σε συνεργασία με μία από τις RanBP2 (κυτταροπλασματικό ινίδιο) και τη μικρή διαλυτή RanBP1. Το σύμπλοκο RAN-GDP που προκύπτει αλληλεπιδρά με τον πυρηνικό παράγοντα μεταφοράς NTF2 με αποτέλεσμα την μεταφορά του πίσω στον πυρήνα μέσω των πυρηνικών πόρων. Στον πυρήνα ο παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης RAN- GEF (Guanine nucleotide exchange factor), RCC1, αποκαθιστά τα επίπεδα της RAN-GTP. Επιπλέον, η καρυοφερίνη CRM1 ανακυκλώνεται και επιστρέφει στον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου, ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί εκ νέου.[11]

Έλεγχος σταθερότητας του mRNA[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Πρόσφατες επιστημονικές μελέτες έχουν δείξει ότι η σταθερότητα του mRNA είναι υψηλά ρυθμιζόμενη, ποικίλει κατά την ανάπτυξη και ανάλογα με τους περιβαλλοντικούς παράγοντες και ότι είναι δυνατό, συγκεκριμένα RNA να στοχευθούν για αποικοδόμηση.[14][15][16][17] Η διαμόρφωση της σταθερότητας του mRNA παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη γονιδιακή ρύθμιση.

Η σταθερότητα ενός mRNA μετάγραφου καθορίζεται από την ύπαρξη αλληλουχιών εντός του mRNA, γνωστών ως cis- στοιχεία, που μπορεί να έχουν προσκολλημένες trans- ενεργές RNA- προσδεόμενες πρωτεΐνες (RNA binding proteins) για την αναστολή ή την ενίσχυση της αποσύνθεσης του mRNA.

Τα cis- στοιχεία είναι αλληλουχίες εντός του mRNA οι οποίες εμπλέκονται στον προσδιορισμό του βασικού χρόνου υποδιπλασιασμού ενός συγκεκριμένου mRNA, στη σταθεροποίηση ή μη του mRNA, ως ανταπόκριση σε πολυάριθμα ερεθίσματα, αλλά και στην τελική υποβάθμιση του mRNA. Βρίσκονται συνήθως στο 3’ UTR και αποτελούν στόχο για την πρόσδεση trans- ενεργών RNA- προσδεόμενων πρωτεϊνικών παραγόντων [18].

  • AU rich Elements (AREs)

Δρουν ως αποσταθεροποιητές[19], είναι 50- 150 nt σε μήκος και αντιπροσωπεύουν ένα μεγάλο εύρος από AU- rich αλληλουχίες[20]. Η αποσύνθεση του mRNA μέσω AREs είναι σημαντική για τη διατήρηση χαμηλών επιπέδων έκφρασης πολλών πρωτεϊνών.

  • Iron Response Elements (IREs)

Ο σίδηρος συμμετέχει στη μετάφραση διαφόρων mRNA, προσδεόμενος σε 31 ή 51 δομές στελέχους- θηλιάς, τα Iron- response Elements (IREs). Τα mRNA για τον υποδοχέα της τρανσφερίνης, ελαφριές και βαριές αλυσίδες φεριτίνης, μια μορφή συνθετάσης ερυθρολυτικού αμινολεβουλινικού οξέος, καθώς και μια μορφή μιτοχονδριακής ακονιτάσης, ελέγχονται από IREs και μια πρωτεϊνη που προσδένεται σε αυτά (IREBP). To IRE στο mRNA της φεριτίνης είναι στην 5’ πλευρική αλληλουχία και η μετάφραση του mRNA ρυθμίζεται από την πρόσδεση της IREBP, της οποίας η δραστηριότητα εξαρτάται από τη συγκέντρωση σιδήρου στο κύτταρο. Αντιθέτως, το IRE του mRNA της τρανσφερίνης βρίσκεται στην 3’ αλληλουχία και η πρόσδεση πρωτεϊνης IREBP σε αυτό ρυθμίζει την αποσύνθεση του mRNA. Επομένως, η πρόσδεση IREBP σε IREs φεριτίνης και τρανσφερίνης αυξάνει το βαθμό μετάφρασης του mRNA τρανσφερίνης και αναστέλλει τη μετάφραση mRNA φεριτίνης [21]. Τα IREs ρυθμίζουν την αποσύνθεση ή τη μετάφραση του mRNA, ανάλογα με τη θέση τους [22], έχουν μήκος 26-30 nt και δομή φουρκέτας.

  • Thyrotropin Releasing Hormone Receptor (TRH-R)

H TRHR παράγεται στον υποθάλαμο και επηρεάζει πολυάριθμες ζωτικές λειτουργίες, όπως η σύνθεση της θυροτροπίνης (TSH), η ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων, η γνωσιακή λειτουργία, η ανάπτυξη και η αντίληψη του πόνου. Δρα μέσω των συγγενικών υποδοχέων TRHR1[23];[24] και TRHR2 [25]. Ο TRHR1 εκφράζεται κυρίως στην υπόφυση [26], ενώ Ο TRHR2 στο νευρικό ιστό [27]. Οι μηχανισμοί μεταμεταγραφικής τροποποίησης παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης του TRHR1, σε επίπεδο αποσύνθεσης του RNA [28].

RNA binding proteins (RBP)[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Οι RNA binding proteins (RBP) παίζουν καθοριστικό ρόλο στη μέτα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, συμμετέχοντας σε διεργασίες όπως το μάτισμα, η έξοδος από τον πυρήνα, η σταθερότητα καθώς και η αποικοδόμηση του RNA[29] . Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η ρύθμιση του μεταβολισμού του RNA, από την σύνθεση έως την αποικοδόμηση του. Υπολογίζεται ότι οι RBP αποτελούν περίπου το 3-11% του πρωτεώματος στα βακτήρια, τα αρχαία και τα ευκάρυα καθώς και ότι εμφανίζουν μεγαλύτερο βαθμό συντήρησης από τις πρωτεΐνες που δεν διαθέτουν την ικανότητα πρόσδεσης στο RNA[30] Οι RBPs αντιπροσωπεύουν μία από τις μεγαλύτερες οικογένειες πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται στο ανθρώπινο γονιδίωμα[31].

Οι RBPs προσδένονται, μέσω  καθορισμένων δομικών επικρατειών (RNA binding domains- RBDs), πάνω σε συγκεκριμένα RNA, σχηματίζοντας ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα (RNPs) [29]. Πιο συγκεκριμένα, η ειδικότητα της πρόσδεσης επιτυγχάνεται μέσα από αναγνώριση είτε της πρωτοταγούς αλληλουχίας,  είτε της δομής του RNA, είτε σε κάποιες περιπτώσεις του συνδυασμού και των δύο[31]. Κάθε RBP μπορεί να διαθέτει μία ή περισσότερες RBDs. Οι καλύτερα χαρακτηρισμένες επικράτειες είναι οι : RNA Recognition Motif (RRM), K-homology domain (KH), RGG (Arg-Gly-Gly) box, zinc finger, double stranded RNA-binding domain (dsRBD), Pumilio/PUF domain και Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) domain[32]. Η RRM αποτελεί την πιο συχνά εμφανιζόμενη και καλύτερα μελετημένη από τις παραπάνω επικράτειες[32]. Σχηματίζεται από μια β-πτυχωτή επιφάνεια, αποτελούμενη από 4 αντιπαράλληλους β-κλώνους, που περιβάλλεται από 2 α-έλικες. Στην αναγνώριση του RNA, η οποία πραγματοποιείται πάνω στις β-πτυχωτές επιφάνειες, συμμετέχουν αρωματικά αμινοξέα[31]. Η K-homology domain αποτελείται από μία β-πτυχωτή επιφάνεια με 3 β-κλώνους που πακετάρεται μαζί με 3 α-έλικες. Εδώ η αναγνώριση του RNA εξαρτάται από την συμπληρωματικότητα των δομών σε συνδυασμό με τους δεσμούς Η και τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις[31]. Εκτός από τις προαναφερθείσες βασικές επικράτειες πρόσδεσης, μια RBP μπορεί να διαθέτει και μία ή περισσότερες άλλες βοηθητικές επικράτειες, οι οποίες πολύ συχνά υφίστανται μέτα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και οι οποίες επιτρέπουν αλληλεπιδράσεις και με άλλες πρωτεΐνες[33]. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με το πιθανό εναλλακτικό μάτισμα των mRNA από τα οποία θα προκύψουν RBP, αυξάνει την δομική και λειτουργική ποικιλομορφία των πρωτεϊνών αυτών, επιτρέποντας την δημιουργία πολλών διαφορετικών ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων στο κύτταρο. Παρακάτω γίνεται αναφορά σε ορισμένες RBP που συμμετέχουν στα στάδια που μεσολαβούν από την μεταγραφή του mRNA έως την μεταφορά του στο κυτταρόπλασμα.

Επισκόπηση των κύριων οδών μέτα-μεταγραφικής ρύθμισης γονιδίων σε ευκαρυώτες. Απεικονίζεται η βιογένεση, η αποσύνθεση και η λειτουργία των πιο άφθονων RNAs: μεταφορικά RNA (tRNAs), ριβοσωμικά RNA (rRNAs), μικρά πυρηνικά RNAs (snRNAs), mRNAs, microRNAs (miRNAs), RNAs που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες PIWI (piRNAs), και μεγάλα μη κωδικά RNAs (lncRNAs).

Εναλλακτικό μάτισμα[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Το εναλλακτικό μάτισμα αποτελεί μια σημαντική διεργασία στην οποία λαμβάνουν μέρος οι RBP. Τουλάχιστον το 74% των ανθρώπινων γονιδίων δίνουν πολλαπλά μετάγραφα μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Ένα παράδειγμα αποτελούν οι πρωτεΐνες Nova που ελέγχουν το εναλλακτικό μάτισμα μιας σειράς από πρόδρομα mRNAs (παραδείγματος χάριν gephyrins 1–2, JNK2, flamingo 1, neogenin), αναγνωρίζοντας αλληλουχίες YCAY (Υ αναφέρεται σε πυριμιδίνη U ή C), εντός των ιντρονίων. Καθεμία από τις πρωτεΐνες Nova περιλαμβάνει 3 επικράτειες KH. Η πλειονότητα των mRNA στόχων, των πρωτεϊνών Nova, κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εντοπίζονται στις συνάψεις, συνδέοντας έτσι τις πρωτεΐνες Nova με τη ρύθμιση παραγόντων που εμπλέκονται στη διατήρηση της νευρωνικής πλαστικότητας. Η απώλεια των πρωτεϊνών Nova, ως αποτέλεσμα της αυτοάνοσης παρανεοπλασματικής νευρολογικής διαταραχής (paraneoplastic neurologic disorder-PND), οδηγεί σε νευρολογικά συμπτώματα υπερβολικής  κίνησης (Paraneoplastic Opsoclonus Myoclonus Ataxia, POMA)[33].

Τροποποίηση του RNA[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Το RNA editing είναι ο πιο διαδεδομένος τύπος τροποποίησης του RNA και περιλαμβάνει την μετατροπή της αδενοσίνης (Α) σε ινοσίνη (Ι), μια αντίδραση που καταλύεται από τις πρωτεΐνες ADAR.  Ενώ η πλειονότητα αυτών των αντιδράσεων παρατηρείται σε μη-κωδικές περιοχές, έχουν ταυτοποιηθεί κάποια γονίδια τα οποία υφίστανται RNA editing στις κωδικές περιοχές τους. Το πρόδρομο RNA, το οποίο αποτελεί υπόστρωμα της πρωτεΐνης ADAR, είναι ένα δίκλωνο RNA που εμφανίζει ατελή συμπληρωματικότητα βάσεων. Η δομή αυτή σχηματίζεται ανάμεσα στο εξώνιο που περιέχει την αδενοσίνη, η οποία πρόκειται να τροποποιηθεί, και σε μία μη-κωδική αλληλουχία ενός ιντρονίου. Ένα κλασσικό παράδειγμα RNA editing αδενοσίνης-ινοσίνης, αποτελεί η μετατροπή μιας γλουταμίνης σε αργινίνη, στο mRNA του υποδοχέα γλουταμικού GluR-B[33].

Πολυαδενυλίωση[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

           Όλα σχεδόν τα ευκαρυωτικά mRNA υφίστανται επεξεργασία για την απόκτηση πολύ-Α ουράς μήκους περίπου 200 νουκλεοτιδίων στο 3’ άκρο. Εξαίρεση αποτελούν μερικά mRNA των ιστονών. Η διαδικασία της πολυαδενυλίωσης περιλαμβάνει 2 στάδια. Αρχικά, το μετάγραφο κόβεται ανάμεσα στην συντηρημένη ακολουθία ΑΑUΑΑΑ και σε μια εκφυλισμένη ακολουθία πλούσια σε U/GU. Στη συνέχεια, γίνεται η προσθήκη της πολύ-Α ουράς από την πολύ-Α πολυμεράση. Απαραίτητη είναι και η παρουσία της πρωτεΐνης CPSF, η οποία αποτελείται από 4 πολυπεπτίδια. Η πρωτεΐνη αυτή προσδένεται στην αλληλουχία ΑΑUΑΑΑ μέσω των πεπτιδίων CPSF-160 και CPSF-30. Η CPSF, μαζί με την ΡΑΒΡΝ1 (nuclear poly(A) binding protein), διεγείρει τη δραστικότητα της πολύ-Α πολυμεράσης, η οποία είναι ουσιαστικά ανενεργή από μόνη της. Στην αλληλεπίδραση αυτή συμμετέχει η επικράτεια RBD της ΡΑΒΡΝ1[33].

Έξοδος από τον πυρήνα[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

           Το ετεροδιμερές TAP/ NXF1:p15 παίζει καθοριστικό ρόλο κατά την έξοδο των mRNA μορίων από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Τόσο η TAP όσο και ο p15 εμφανίζουν μικρή συγγένεια για το RNA. Για το λόγο αυτό απαραίτητη είναι η παρουσία πρωτεϊνών προσαρμογής  για τη μεσολάβηση της αλληλεπίδρασης. Πιο συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη Aly / REF αλληλεπιδρά άμεσα με την ΤΑΡ και την μεταφέρει στο mRNA[33].

Εντοπισμός του RNA[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

           Σημαντικό ρόλο παίζει και η θέση εντοπισμού του RNA στο κύτταρο. Παράδειγμα αποτελεί το mRNA της πρωτεΐνης ASH1 του S. Cerevisiae, το οποίο αλληλεπιδρώντας με τις πρωτεΐνες μυοσίνη και ακτίνη, εντοπίζεται στο εκβλάστημα από το οποίο θα προκύψει το θυγατρικό κύτταρο μετά την κυτταρική διαίρεση.  Πιο συγκεκριμένα, η She2 προσδένεται ως διμερές σε αλληλουχίες εντοπισμού, που εντοπίζονται στην κωδική περιοχή και την 3’UTR του ASH1 mRNA. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της συγγένειας πρόσδεσης της She2 στο καρβοξυτελικό άκρο της She3. Η She3 στη συνέχεια προσδένεται στην μυοσίνη. Η εντοπισμένη αυτή έκφραση της πρωτεΐνης ASH1 οδηγεί στην καταστολή της αλλαγής του συζευκτικού τύπου στο θυγατρικό κύτταρο[33].

Σταθερότητα του RNA[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

           Πολλές RBPs, όπως οι tristetraprolin (TTP), fragile X mental retardation protein (FMRP), polypyrimidine tract-binding protein (PTB), CUG triple repeats RNA-binding protein (CUGBP), nucleolin, και heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNP) A1, A2, and C1/C2 επηρεάζουν την σταθερότητα του mRNA, αλληλεπιδρώντας με τις 3’UTR ή 5’UTR ή ακόμα και την κωδική περιοχή των μεταγράφων[34]. Πιο συγκεκριμένα, πρωτεΐνες όπως οι AUF1 ή TTP προωθούν την αποικοδόμηση, μειώνοντας το χρόνο ημιζωής των mRNA και περιορίζοντας τα επίπεδα των πρωτεϊνών[34]. Από την άλλη μεριά πρωτεΐνες όπως η οικογένεια των ELAV/ Hu συμβάλουν στην σταθερότητα μεταγράφων[34]. Πιο συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες αυτές προσδένονται σε αλληλουχίες πλούσιες σε AU (AU-rich elements/ AREs), που εντοπίζονται στις 3’UTR mRNA μορίων[34]. Πρόκειται για mRNA γονιδίων πρώιμης απόκρισης που εκφράζονται κυρίως στους νευρώνες. Οι HuB, HuC και HuD εκφράζονται ειδικά στους νευρώνες , ενώ η HuR παρουσιάζει καθολική έκφραση. Καθεμία από τις Hu πρωτεΐνες περιέχει 3 RBDs, εκ των οποίων οι δύο πρώτες συμμετέχουν στην πρόσδεση των πρωτεϊνών Hu στα στοιχεία ARE. Οι πρωτεΐνες αυτές σταθεροποιούν πολλά από τα mRNA στα οποία προσδένονται (όπως .c-fos, GM-CSF, EGF) [33].

Γονιδιακή αποσιώπηση με miRNA και siRNA[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Σημαντικό βήμα για την επιστήμη θεωρείται η ανακάλυψη μικρών (20-30 nt), μη κωδικών RNA, τα οποία ρυθμίζουν γονίδια και γονιδιώματα, σε επίπεδο μεταγραφικό και μεταμεταγραφικό. Η δράση των μικρών RNA είναι γενικότερα ανασταλτική, και δρουν ως εξειδικευμένοι παράγοντες που καθοδηγούν προσδεμένες πρωτεΐνες, μέσω αλληλεπιδράσεων σύζευξης βάσεων. Ρυθμιστικά μονοπάτια που ελέγχονται από αυτά τα μικρά RNAs ονομάζονται γενικά RNA interference (RNAi), ή RNA silencing. Το RNA interference (RNAi) είναι μια τεχνική κατά την οποία εξωγενές δίκλωνο RNA (dsRNAs), το οποίο είναι συμπληρωματικό σε γνωστό mRNA, εισάγεται σε ένα κύτταρο για να καταστρέψει το συγκεκριμένο mRNA, με συνέπεια την ελάττωση ή την πλήρη κατάργηση της γονιδιακής έκφρασης.

Υπάρχουν τρεις βασικές κατηγορίες μικρών μη κωδικών RNA: τα short interfering RNA (siRNA), τα microRNA (miRNA) και τα piwi interacting RNA (piRNA). Όλα χαρακτηρίζονται από τη δίκλωνη φύση των προδρόμων τους.

Τα siRNA και τα miRNA προσδένονται σε πρωτεΐνες μέλη του κλάδου Ago της οικογένειας Argonaute, ενώ τα piRNA σε μέλη του κλάδου Piwi. Τα miRNA δρουν ως ρυθμιστές ενδογενών γονιδίων, ενώ τα siRNA ως υπερασπιστές της ακεραιότητας του γονιδιώματος, εναντίον ξένων νουκλεϊκών οξέων-εισβολέων.

Τα μονόκλωνα miRNA και siRNA σχετίζονται με το Επαγόμενο από RNA Σύμπλοκο Αποσιώπησης, (RNA Induced Silencing Complex, RISC) [35]. Σε όλες τις περιπτώσεις, η ταυτότητα του γονιδίου που πρόκειται να σιγηθεί καθορίζεται από το μέρος του μικρού RNA που αναγνωρίζει το στόχο μέσω Watson-Crick base pairing. Έτσι, η σίγηση με miRNA και siRNA μπορεί εύκολα να επαναπρογραμματιστεί.

Τα miRNA αποτελούνται από έως και 25 αλληλουχίες RNA, μερικώς συμπληρωματικές των 3’ UTR του mRNA- στόχου. Τα primary miRNA (pri- miRNA) μετάγραφά τους διασπώνται αρχικά στον πυρήνα από την Drosha, ένα ένζυμο RNaseIII. Αργότερα μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα, με τη βοήθεια του μορίου exportin-5 και εκεί μετατρέπονται σε δίκλωνες αλυσίδες miRNA/miRNA, με την καταλυτική δράση του RNaseIII ενζύμου Dicer, το οποίο αφαιρεί τη θηλιά της δίκλωνης αλυσίδας. Η αλυσίδα miRNA, μαζί με την ενδονουκλεάση AGO2 και άλλες πρωτεϊνες, σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα ενζύμων, το RNA- induced silencing complex (RISC). Τα miRNA καθοδηγούν το RISC στο mRNA- στόχο, μέσω μερικώς συμπληρωματικών αλληλουχιών, για την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης. Τα miRNA έχουν βρεθεί σε ευκαρυωτικούς φυτικούς και ζωικούς οργανισμούς και κωδικοποιούνται από πλήθος γονιδίων.

Η Drosha (dsRNA-specific ribonuclease) κόβει το pri-miRNA ώστε να απελευθερωθεί η δομή φουρκέτας (precursor miRNA /pre-miRNA)

Τα siRNA είναι δίκλωνα μόρια RNA, μήκους έως και 21 nt, επεξεργάζονται με τον ίδιο τρόπο από το Dicer, το οποίο οδηγεί στη δημιουργία δύο εξέχοντων νουκλεοτιδίων στα 3’ άκρα. Αυτά τα dsRNA εμπλέκονται στο RNAi μονοπάτι, σχηματίζοντας RISC με AGO2 και άλλες πρωτεϊνες και οδηγώντας το στην αλληλουχία mRNA- στόχο, αναστέλλοντας τη μετάφρασή της.

Η λειτουργική εξειδίκευση μεταξύ miRNA και siRNA σίγησης είναι ξεκάθαρη στα φυτά, στις μύγες, στα σκουλήκια, ακόμη και μεταξύ μελών του ίδιου κλάδου[36].

Η κινητήρια δύναμη του RNAi είναι ένα μεγάλο γραμμικό και απόλυτα συζευγμένο δίκλωνο μόριο RNA, προερχόμενο από το περιβάλλον ή κατευθείαν από τον πυρήνα[37]. Τα dsRNA μόρια αυτά επεξεργάζονται από την Dicer μέσα στα siRNA που ρυθμίζουν την γονιδιακή σίγηση.

Τα siRNA δρουν για την άμυνα του γονιδιώματος και δεν είναι μόνο προϊόντα από ξένα νουκλεικά οξέα, αλλά προκύπτουν και από ενδογενείς γονιδιωματικούς τόπους. Διαφέρουν από τα ενδογενή siRNA στο ότι αυτά ή οι πρόδρομοί τους περνάνε υποχρεωτικά από μια πυρηνική φάση.


Διαφορές siRNA/miRNA
siRNA miRNA
ΔΟΜΗ Δίκλωνο Μονόκλωνο
ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ Εξωγενής/Ενδογενής Ενδογενής
ΑΡΙΘΜΟΣ mRNA ΣΤΟΧΩΝ 1 Πολλά
ΒΑΘΜΟΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΜΕ ΤΟ mRNA ΣΤΟΧΟ Τέλεια Ατελής/ Τέλεια
ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΤΟ mRNA Ενδονουκλεοτιδική διάσπαση του mRNA Καταστολή της μετάφρασης του mRNA/ Ενδονουκλεοτιδική διάσπαση του mRNA

Η κυριότερη διαφορά των miRNA και siRNA εντοπίζεται στην ακρίβεια των άκρων τους. Τα microRNA συμπεριφέρονται ως παραδοσιακά πολυμερή προϊόντα της λειτουργίας των γονιδίων και συνεπώς τα περισσότερα είδη έχουν πολύ συγκεκριμένα άκρα με ελάχιστη διαφοροποίηση. Αντιθέτως τα siRNA είναι περισσότερο ετερογενή όσον αφορά τη σύσταση των άκρων τους. Επίσης, τα miRNA είναι κατάλοιπα RNA μήκους 21 nt, που προέρχονται από μεγαλύτερα RNA που περιέχουν ατελώς συζευγμένα τμήματα μεγέθους 70 nt με δομή φουρκέτας και αποτελούν τον πρόδρομο του ώριμου miRNA. Τα siRNA από την άλλη, ενώ έχουν παρόμοιο μήκος, προέρχονται από μεγαλύτερα τέλεια συζευγμένα δίκλωνα μόρια RNA ενδογενούς ή εξωγενούς προέλευσης [38]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η διάκριση των miRNA και siRNA βασίζεται αποκλειστικά στη διαφορετική τους προέλευση και βιογένεση και είναι ανεξάρτητη του βαθμού συμπληρωματικότητας του στόχου και της ικανότητας του 21 nt RNA να προωθήσει το ενδονουκλεολυτικό σχίσιμο του mRNA στόχου.

miRNA και στρες[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Τα miRNAs εμπλέκονται συχνά στην απόκριση σε συνθήκες στρες. Σε κάποια από αυτά επάγεται ή αναστέλλεται η έκφρασή τους, παρουσιάζοντας το ίδιο μοτίβο απόκρισης, ενώ άλλα παρουσιάζουν διαφορετική απόκριση που εξαρτάται από τον παράγοντα στρες. Επίσης, κάτω από συνθήκες στρες, τα lncRNAs των φυτών μπορούν να λειτουργήσουν 1) ως ceRNAs, τα οποία γίνονται στόχος ειδικών miRNAs, τα οποία τελικά απομακρύνονται από τον αρχικό τους στόχο, 2) ως πρόδρομα sRNA ώστε να παράγουν miRNAs και siRNAs, 3) ως συμπληρωματικές αλληλουχίες σε mRNAs στόχους και 4) ως παράγοντες τροποποίησης της δομής της χρωματίνης[39].

Οι πρωτεΐνες DICER[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Μία τάξη μεγάλων RNase III ενζύμων χαρακτηρίζεται από διάφορους τομείς με συγκεκριμένη σειρά, από το αμινο- προς το καρβοξυ- τέρμα: έναν τομέα DEXD/H ATPase, έναν DUF283, έναν PAZ τομέα, δύο διαδοχικούς RNase III τομείς και έναν dsRNA-bnding τομέα (dsRBD). Ένας γενικός κανόνας προτείνει ότι οργανισμοί με πολλαπλές DICER παρουσιάζουν λειτουργική εξειδίκευση μεταξύ τους. Για παράδειγμα, στη Drosophila η Dicer 1 είναι απαραίτητη για τη βιογένεση του miRNA, ενώ η Dicer 2 χρειάζεται περισσότερο για το μονοπάτι του siRNA [40].

Οι πρωτεϊνες Dicer σχίζουν τα δίκλωνα πρόδρομα RNA με τη βοήθεια δύο τομέων RNase ΙΙΙ. Η επεξεργασία γίνεται στα άκρα του dsRNA που σχετίζονται με τον PAZ τομέα, ο οποίος υπάρχει στις περισσότερες Dicer. Το υπόστρωμα τοποθετείται αργότερα στα ενεργά μέρη των RNase ΙΙΙ τομέων, που αποκόπτουν το miRNA/siNRA δίκλωνο μόριο, μήκους 20-30 nt, από τον πρόδρομό τους.

Η δομή των πρωτεϊνών Dicer.

Οι τομείς PAZ και RNase ΙΙΙ έχουν καθοριστικό ρόλο στην αποκοπή siRNA από τα άκρα δίκλωνων μορίων RNA. Οι τομείς PAZ υπάρχουν και στις πρωτεΐνες Argonaute και εξειδικεύονται στο να προσδένουν RNA άκρα με μικρές (2 nt) 3’ προεξοχές. Η ATP προωθεί την επεξεργασία του δίκλωνου RNA, μέσω της Dicer 2 της Drosophila και την Dicer 1 του C. elegans και μεταλλάξεις που προβλέπεται να καταστρέψουν τη δράση της ATPase στην Dicer 2 της Drosophila, καταργούν την επεξεργασία του dsRNA. Αντιθέτως, η ATP είναι περιττή για την επεξεργασία του dsRNA από ανθρώπινη Dicer και ένα μετάλλαγμα ελλειπές ως προς την ATPase δεν παρουσιάζει κανένα πρόβλημα.

Οι πρωτεΐνες ARGONAUTE[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Η υπεροικογένεια των πρωτεϊνών Argonaute χωρίζεται σε τρεις ξεχωριστές υποομάδες: την ομάδα PIWI (που προσδένεται σε piRNA), την ομάδα AGO (που προσδένεται σε miRNA και siRNA) και μια τρίτη ομάδα που έχει βρεθεί και μελετηθεί μόνο σε νηματώδεις. Οι Argonaute είναι κεντρικοί, καθοριστικοί παράγοντες του RISC. Τα δίκλωνα προϊόντα της Dicer εισέρχονται σε ένα μονοπάτι του RISC, που περιλαμβάνει την εκτύλιξη του δίκλωνου μορίου, επιτρέποντας σε μία από τις δύο αλυσίδες να σχηματίσει σταθερή σύνδεση με την πρωτεΐνη Ago [41]. Η αλυσίδα αυτή καθοδηγεί την αναγνώριση του στόχου μέσω Watson- Crick base pairing και η άλλη αλυσίδα απορρίπτεται.

Οι πρωτεΐνες Argonaute έχουν 4 σαφείς τομείς: τον τομέα PAZ (που υπάρχει και στις Dicer), τον PIWI, τον Ν και τον MID τομέα. Η δομή τους είναι δίλοβη, με τον έναν λοβό να αποτελείται από τον PAZ τομέα και τον άλλο από τον PIWI και τους γειτονικούς N και MID τομείς. Ο τομέας PIWI υιοθετεί μία RNase H- like αναδίπλωση, που σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να δράσει ως καταλύτης στο ενδονουκλεολυτικό σχίσιμο ενός στόχου με συζευγμένες βάσεις [42];[43].

Η δομή των πρωτεϊνών Argonaute.

Παρόλο που τα μονόκλωνα siRNA μπορούν να συνδεθούν κατευθείαν με πρωτεΐνες Argonaute [44], τα δίκλωνα siRNA που δημιουργούνται από την Dicer δεν μπορούν και βασίζονται σε μονοπάτια siRISC. Διαφορετικές κατηγορίες siRNA βασίζονται σε διαφορετικές πρωτεΐνες για να λειτουργήσουν και ως εκ τούτου έχουν διαφορετική βιογένεση και μονοπάτια RISC.

Το μονοπάτι RISC[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

Το μονοπάτι της γονιδιακής αποσιώπησης. Ένα σταθερό πρωτεϊνικό διμερές συνδέεται στο διπλής αλυσίδας RNA και το υδρολύει σε μικρά RNA μόρια. Η μία υπομονάδα από το ετεροδιμερές συνιστά μέλος της οικογένειας RNA III ενζύμων και ονομάζεται Dicer 2 (DCR2) και η άλλη μία RNA συνδεόμενη πρωτεΐνη, με 2 δομές ειδικές για σύνδεση με διπλής αλυσίδας RNA, που ονομάζεται R2D2. Το DCR2-R2D2 ετεροδιμερές μετατρέπει το διπλής αλυσίδας RNA σε μικρά RNA μόρια παρεμβολής. (siRNA). Mια από τις 2 αλυσίδες του siRNA ενσωματώνεται σε ένα RNA επαγόμενο σύμπλεγμα αποσιώπησης (RNA Induced Silencing Complex: siRISC) το οποίο καταλύει την θραύση του mRNA στόχου. Η συγκρότηση του siRISC φαίνεται να απαιτεί την συγκρότηση πρόδρομου συμπλέγματος που σημειώνεται σαν RLC (RISC Loading Complex), το οποίο εμπεριέχει την διπλή αλυσίδα του siRNA, το DCR2-R2D2 ετεροδιμερές και επιπρόσθετες πρωτεΐνες οι οποίες πρέπει να χαρακτηριστούν. Το RLC σύμπλεγμα θεωρείται ότι καταλύει το ATP-εξαρτώμενο ξετύλιγμα του διπλής αλυσίδας siRNA. Η μία από τις 2 αλυσίδες, η οδηγός αλυσίδα, συμπλέκεται τελικά με στο siRISC , ενώ η άλλη αλυσίδα, δηλαδή η επιβαίνουσα αλυσίδα (passenger) απομακρύνεται και καταστρέφεται. ΤοsiRISC περιέχει επίσης μία πρωτεΐνη η οποία ονομάζεται Αργοναύτης (Argonaute: AGO) και η οποία καταλύει την υδρόλυση του RNA. H οδηγός (Guide) αλυσίδα καθοδηγεί το siRISC σε ένα mRNA με συμπληρωματική αλληλουχία. Στην συνέχεια η AGO πρωτεΐνη κόβει τον mRNA στόχο σε μία μονή θέση στο κέντρο περίπου της δημιουργηθείσας διπλής αλυσίδας περιοχής, 10 νουκλεοτίδια από το 5΄-άκρο του siRNA.

O μηχανισμός RISC είναι παρόμοιος για τα miRNA και τα siRNA και ξεκινάει με τη φόρτωση των δίκλωνων miRNA/miRNA* ή των siRNA στην Ago (duplex loading) [45]. Αυτό οδηγεί στη δημιουργία ενός συμπλόκου που αποτελείται από την AGO και το δίκλωνο μικρό RNA, που ονομάζεται preRISC. Η διαδικασία αυτή είναι δυναμική και απαιτεί υδρόλυση της ATP. Ο κλώνος- επιβάτης προκαθορίζεται από την πόλωση της φόρτωσης στην AGO [46];[47]. Ο κλώνος- οδηγός είναι εκείνος που συνορεύει με το θερμοδυναμικά λιγότερο σταθερό base pairing, στο 5’ άκρο. Το δεύτερο στάδιο είναι το στάδιο της σφήνας (wedging), κατά το οποίο ο Ν τομέας της Ago στρέφεται προς τα έξω και λειτουργώντας σαν σφήνα χωρίζει τις συζευγμένες βάσεις στο 3’ άκρο. Το τρίτο και τελευταίο στάδιο του RISC ονομάζεται αποβολή του επιβάτη (passenger ejection). Τα δύο μικρά RNA διαχωρίζονται και ο κλώνος- επιβάτης απορρίπτεται από την Ago.

Παραπομπές[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]

  1. Bruce., Alberts,. Nikolaos., Anagnou, (2006). Vasikes arches kyttarikēs viologias : eisagōgē stē moriakē viologia tou kyttarou (2ē ekd έκδοση). Athēna: Iatrikes ekdoseis P. Ch. Paschalidēs. 880485779. ISBN 9603993883. https://www.worldcat.org/oclc/880485779. 
  2. 1928-, Watson, James D., (2008). Molecular biology of the gene (6th ed έκδοση). San Francisco: Pearson/Benjamin Cummings. 173182652. ISBN 9780805395921. https://www.worldcat.org/oclc/173182652. 
  3. Nieto Moreno, Nicolás; Giono, Luciana E.; Cambindo Botto, Adrián E.; Muñoz, Manuel J.; Kornblihtt, Alberto R. (2015-08-18). «Chromatin, DNA structure and alternative splicing» (στα αγγλικά). FEBS Letters 589 (22): 3370–3378. doi:10.1016/j.febslet.2015.08.002. ISSN 0014-5793. http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2015.08.002. 
  4. Saldi, Tassa; Cortazar, Michael A.; Sheridan, Ryan M.; Bentley, David L. (2016-06). «Coupling of RNA Polymerase II Transcription Elongation with Pre-mRNA Splicing». Journal of Molecular Biology 428 (12): 2623–2635. doi:10.1016/j.jmb.2016.04.017. ISSN 0022-2836. PMID 27107644. PMC PMC4893998. http://dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2016.04.017. 
  5. 5,0 5,1 Proudfoot, Nick J.; Furger, Andre; Dye, Michael J. (2002-02-22). «Integrating mRNA processing with transcription». Cell 108 (4): 501–512. ISSN 0092-8674. PMID 11909521. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11909521. 
  6. Quiocho, F. A.; Hu, G.; Gershon, P. D. (2000-2). «Structural basis of mRNA cap recognition by proteins». Current Opinion in Structural Biology 10 (1): 78–86. ISSN 0959-440X. PMID 10679461. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10679461. 
  7. Leung, Daisy W.; Amarasinghe, Gaya K. (2016-2). «When your cap matters: structural insights into self vs non-self recognition of 5' RNA by immunomodulatory host proteins». Current Opinion in Structural Biology 36: 133–141. doi:10.1016/j.sbi.2016.02.001. ISSN 1879-033X. PMID 26916433. PMC PMC5218996. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26916433. 
  8. Braunschweig, Ulrich; Gueroussov, Serge; Plocik, Alex M.; Graveley, Brenton R.; Blencowe, Benjamin J. (2013-03). «Dynamic Integration of Splicing within Gene Regulatory Pathways». Cell 152 (6): 1252–1269. doi:10.1016/j.cell.2013.02.034. ISSN 0092-8674. PMID 23498935. PMC PMC3642998. http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.02.034. 
  9. «A Conserved mRNA Export Machinery Coupled to pre-mRNA Splicing» (στα αγγλικά). Cell 108 (4): 523–531. 2002-02-22. doi:10.1016/S0092-8674(02)00627-X. ISSN 0092-8674. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286740200627X. 
  10. 10,0 10,1 10,2 10,3 10,4 Katahira, Jun (2012-6). «mRNA export and the TREX complex». Biochimica Et Biophysica Acta 1819 (6): 507–513. doi:10.1016/j.bbagrm.2011.12.001. ISSN 0006-3002. PMID 22178508. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22178508. 
  11. 11,0 11,1 11,2 11,3 11,4 11,5 11,6 11,7 Delaleau, Mildred; Borden, Katherine L. B. (2015-08-28). «Multiple Export Mechanisms for mRNAs». Cells 4 (3): 452–473. doi:10.3390/cells4030452. ISSN 2073-4409. PMID 26343730. PMC PMC4588045. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26343730. 
  12. Kailashiya, Jyotsna; Mukherjee, Avijit; Dash, Debabrata (2017-4). «Essentials of medical biochemistry: With clinical cases». The Indian Journal of Medical Research 145 (4): 576–577. doi:10.4103/0971-5916.213764. ISSN 0971-5916. PMC PMC5663179. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5663179/. 
  13. 13,0 13,1 13,2 13,3 Wickramasinghe, Vihandha O.; Laskey, Ronald A. (2015-7). «Control of mammalian gene expression by selective mRNA export». Nature Reviews. Molecular Cell Biology 16 (7): 431–442. doi:10.1038/nrm4010. ISSN 1471-0080. PMID 26081607. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26081607. 
  14. Cooperstock, null; Lipshitz, null (1997-12). «Control of mRNA stability and translation during Drosophila development». Seminars in Cell & Developmental Biology 8 (6): 541–549. doi:10.1006/scdb.1997.0179. ISSN 1096-3634. PMID 9642168. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9642168. 
  15. Cairrão, Fátima; Arraiano, Cecília; Newbury, Sarah (2005-3). «Drosophila gene tazman, an orthologue of the yeast exosome component Rrp44p/Dis3, is differentially expressed during development». Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists 232 (3): 733–737. doi:10.1002/dvdy.20269. ISSN 1058-8388. PMID 15704111. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=cairrao+2005. 
  16. Meyer, Sylke; Temme, Claudia; Wahle, Elmar (2004-7). «Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes». Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 39 (4): 197–216. doi:10.1080/10409230490513991. ISSN 1040-9238. PMID 15596551. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15596551. 
  17. Till, D. D.; Linz, B.; Seago, J. E.; Elgar, S. J.; Marujo, P. E.; Elias, M. L.; Arraiano, C. M.; McClellan, J. A. και άλλοι. (1998-12). «Identification and developmental expression of a 5'-3' exoribonuclease from Drosophila melanogaster». Mechanisms of Development 79 (1-2): 51–55. ISSN 0925-4773. PMID 10349620. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10349620. 
  18. Hollams, Elysia M.; Giles, Keith M.; Thomson, Andrew M.; Leedman, Peter J. (2002-10). «MRNA stability and the control of gene expression: implications for human disease». Neurochemical Research 27 (10): 957–980. ISSN 0364-3190. PMID 12462398. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=hollams+2002. 
  19. Shaw, Gray; Kamen, Robert (2012-07-01). «Pillars article: a conserved AU sequence from the 3' untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation. Cell. 1986. 46: 659-667». Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950) 189 (1): 5–13. ISSN 1550-6606. PMID 22723638. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22723638. 
  20. Chen, C. Y.; Shyu, A. B. (1995-11). «AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation». Trends in Biochemical Sciences 20 (11): 465–470. ISSN 0968-0004. PMID 8578590. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8578590. 
  21. Elsevier. «Essentials of Medical Biochemistry - 2nd Edition». www.elsevier.com (στα Αγγλικά). Ανακτήθηκε στις 28 Μαΐου 2018. 
  22. Theil, E. C. (1998). «The iron responsive element (IRE) family of mRNA regulators. Regulation of iron transport and uptake compared in animals, plants, and microorganisms». Metal Ions in Biological Systems 35: 403–434. ISSN 0161-5149. PMID 9444765. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9444765. 
  23. de la Peña, P.; Delgado, L. M.; del Camino, D.; Barros, F. (1992-12-25). «Two isoforms of the thyrotropin-releasing hormone receptor generated by alternative splicing have indistinguishable functional properties». The Journal of Biological Chemistry 267 (36): 25703–25708. ISSN 0021-9258. PMID 1334485. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1334485. 
  24. Cao, J.; O'Donnell, D.; Vu, H.; Payza, K.; Pou, C.; Godbout, C.; Jakob, A.; Pelletier, M. και άλλοι. (1998-11-27). «Cloning and characterization of a cDNA encoding a novel subtype of rat thyrotropin-releasing hormone receptor». The Journal of Biological Chemistry 273 (48): 32281–32287. ISSN 0021-9258. PMID 9822707. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=duthie+1993+trhr. 
  25. Cao, J.; O'Donnell, D.; Vu, H.; Payza, K.; Pou, C.; Godbout, C.; Jakob, A.; Pelletier, M. και άλλοι. (1998-11-27). «Cloning and characterization of a cDNA encoding a novel subtype of rat thyrotropin-releasing hormone receptor». The Journal of Biological Chemistry 273 (48): 32281–32287. ISSN 0021-9258. PMID 9822707. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=cao+1998+trhr. 
  26. Straub, R. E.; Frech, G. C.; Joho, R. H.; Gershengorn, M. C. (1990-12). «Expression cloning of a cDNA encoding the mouse pituitary thyrotropin-releasing hormone receptor». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87 (24): 9514–9518. ISSN 0027-8424. PMID 2175902. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2175902. 
  27. Heuer, H.; Schäfer, M. K.; O'Donnell, D.; Walker, P.; Bauer, K. (2000-12-11). «Expression of thyrotropin-releasing hormone receptor 2 (TRH-R2) in the central nervous system of rats». The Journal of Comparative Neurology 428 (2): 319–336. ISSN 0021-9967. PMID 11064370. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11064370. 
  28. Narayanan, C. S.; Fujimoto, J.; Geras-Raaka, E.; Gershengorn, M. C. (1992-08-25). «Regulation by thyrotropin-releasing hormone (TRH) of TRH receptor mRNA degradation in rat pituitary GH3 cells». The Journal of Biological Chemistry 267 (24): 17296–17303. ISSN 0021-9258. PMID 1324930. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1324930. 
  29. 29,0 29,1 Hentze, Matthias W.; Castello, Alfredo; Schwarzl, Thomas; Preiss, Thomas (2018-01-17). «A brave new world of RNA-binding proteins» (στα αγγλικά). Nature Reviews Molecular Cell Biology 19 (5): 327–341. doi:10.1038/nrm.2017.130. ISSN 1471-0072. http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nrm.2017.130. 
  30. Beckmann, Benedikt M.; Castello, Alfredo; Medenbach, Jan (2016-06-01). «The expanding universe of ribonucleoproteins: of novel RNA-binding proteins and unconventional interactions» (στα αγγλικά). Pflügers Archiv - European Journal of Physiology 468 (6): 1029–1040. doi:10.1007/s00424-016-1819-4. ISSN 0031-6768. PMID 27165283. PMC PMC4893068. https://link.springer.com/article/10.1007/s00424-016-1819-4. 
  31. 31,0 31,1 31,2 31,3 Vindry, Caroline; Vo Ngoc, Long; Kruys, Véronique; Gueydan, Cyril (2014-06). «RNA-binding protein-mediated post-transcriptional controls of gene expression: Integration of molecular mechanisms at the 3′ end of mRNAs?». Biochemical Pharmacology 89 (4): 431–440. doi:10.1016/j.bcp.2014.04.003. ISSN 0006-2952. http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0006295214002275. 
  32. 32,0 32,1 Oliveira, Camila; Faoro, Helisson; Alves, Lysangela Ronalte; Goldenberg, Samuel; Oliveira, Camila; Faoro, Helisson; Alves, Lysangela Ronalte; Goldenberg, Samuel (2017-3). «RNA-binding proteins and their role in the regulation of gene expression in Trypanosoma cruzi and Saccharomyces cerevisiae». Genetics and Molecular Biology 40 (1): 22–30. doi:10.1590/1678-4685-gmb-2016-0258. ISSN 1415-4757. PMID 28463381. PMC PMC5409782. http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S1415-47572017000100022&lng=en&nrm=iso&tlng=en. 
  33. 33,0 33,1 33,2 33,3 33,4 33,5 33,6 Glisovic, Tina; Bachorik, Jennifer L.; Yong, Jeongsik; Dreyfuss, Gideon (2008-03-13). «RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation» (στα αγγλικά). FEBS Letters 582 (14): 1977–1986. doi:10.1016/j.febslet.2008.03.004. ISSN 0014-5793. PMID 18342629. PMC PMC2858862. http://doi.wiley.com/10.1016/j.febslet.2008.03.004. 
  34. 34,0 34,1 34,2 34,3 Abdelmohsen, Kotb (2012-09-19). Binding Protein. InTech. ISBN 9789535107583. http://www.intechopen.com/books/binding-protein/modulation-of-gene-expression-by-rna-binding-proteins-mrna-stability-and-translation. 
  35. Hammond, Scott M. (2015-06-29). «An overview of microRNAs». Advanced Drug Delivery Reviews 87: 3–14. doi:10.1016/j.addr.2015.05.001. ISSN 1872-8294. PMID 25979468. PMC PMC4504744. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=hammond+2000+mirna. 
  36. Yigit, Erbay; Batista, Pedro J.; Bei, Yanxia; Pang, Ka Ming; Chen, Chun-Chieh G.; Tolia, Niraj H.; Joshua-Tor, Leemor; Mitani, Shohei και άλλοι. (2006-11-17). «Analysis of the C. elegans Argonaute family reveals that distinct Argonautes act sequentially during RNAi». Cell 127 (4): 747–757. doi:10.1016/j.cell.2006.09.033. ISSN 0092-8674. PMID 17110334. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17110334. 
  37. Mello, Craig C.; Conte, Darryl (2004-09-16). «Revealing the world of RNA interference». Nature 431 (7006): 338–342. doi:10.1038/nature02872. ISSN 1476-4687. PMID 15372040. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=mello+conte+2004. 
  38. Ambros, Victor; Lee, Rosalind C.; Lavanway, Ann; Williams, Peter T.; Jewell, David (2003-05-13). «MicroRNAs and other tiny endogenous RNAs in C. elegans». Current biology: CB 13 (10): 807–818. ISSN 0960-9822. PMID 12747828. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=ambros+2003+rnai. 
  39. Wang, Jingjing; Meng, Xianwen; Dobrovolskaya, Oxana B.; Orlov, Yuriy L.; Chen, Ming (2017-10). «Non-coding RNAs and Their Roles in Stress Response in Plants». Genomics, Proteomics & Bioinformatics 15 (5): 301–312. doi:10.1016/j.gpb.2017.01.007. ISSN 1672-0229. PMID 29017967. PMC PMC5673675. https://doi.org/10.1016/j.gpb.2017.01.007. 
  40. Matranga, Christian; Tomari, Yukihide; Shin, Chanseok; Bartel, David P.; Zamore, Phillip D. (2005-11-18). «Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes». Cell 123 (4): 607–620. doi:10.1016/j.cell.2005.08.044. ISSN 0092-8674. PMID 16271386. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16271386. 
  41. Meister, Gunter; Tuschl, Thomas (2004-09-16). «Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA». Nature 431 (7006): 343–349. doi:10.1038/nature02873. ISSN 1476-4687. PMID 15372041. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15372041. 
  42. Stoica, Cezar; Carmichael, Jon B.; Parker, Henry; Pare, Justin; Hobman, Tom C. (2006-12-08). «Interactions between the RNA interference effector protein Ago1 and 14-3-3 proteins: consequences for cell cycle progression». The Journal of Biological Chemistry 281 (49): 37646–37651. doi:10.1074/jbc.M604476200. ISSN 0021-9258. PMID 17043360. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17043360. 
  43. Song, Ji-Joon; Smith, Stephanie K.; Hannon, Gregory J.; Joshua-Tor, Leemor (2004-09-03). «Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity». Science (New York, N.Y.) 305 (5689): 1434–1437. doi:10.1126/science.1102514. ISSN 1095-9203. PMID 15284453. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15284453. 
  44. Liu, Jidong; Rivas, Fabiola V.; Wohlschlegel, James; Yates, John R.; Parker, Roy; Hannon, Gregory J. (2005-12). «A role for the P-body component GW182 in microRNA function». Nature Cell Biology 7 (12): 1261–1266. doi:10.1038/ncb1333. ISSN 1465-7392. PMID 16284623. PMC PMC1804202. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16284623. 
  45. Kawamata, Tomoko; Tomari, Yukihide (2010-7). «Making RISC». Trends in Biochemical Sciences 35 (7): 368–376. doi:10.1016/j.tibs.2010.03.009. ISSN 0968-0004. PMID 20395147. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20395147. 
  46. Schwarz, Dianne S.; Hutvágner, György; Du, Tingting; Xu, Zuoshang; Aronin, Neil; Zamore, Phillip D. (2003-10-17). «Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex». Cell 115 (2): 199–208. ISSN 0092-8674. PMID 14567917. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=schwarz+2003+risc. 
  47. Khvorova, Anastasia; Reynolds, Angela; Jayasena, Sumedha D. (2003-10-17). «Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias». Cell 115 (2): 209–216. ISSN 0092-8674. PMID 14567918. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14567918.